馬 青,楊 平,劉 英,王 月,聶 煒,姚光海,李世軍

炭疽是一種自然疫源性疾病，具有全球流行性。炭疽芽胞桿菌是炭疽的病原體，屬于需氧芽胞桿菌屬細(xì)菌，可感染各種家畜、野生動(dòng)物及人類。由于其病原體的環(huán)境耐受性和感染破壞性等特點(diǎn)，炭疽無法根除。人類主要通過接觸炭疽病畜毛皮和食肉而感染，也可以通過吸入含有炭疽芽胞的粉塵或氣溶膠而感染，主要表現(xiàn)為皮膚炭疽，其次為肺炭疽、腸炭疽和腦膜炎炭疽[1]。

炭疽芽胞桿菌在遺傳過程中，基因組上存在能穩(wěn)定遺傳的單核苷酸突變位點(diǎn)，單核苷酸重復(fù)序列分析(Single-Nucleotide Repeat Analysis, SNR)通過分析不同分離株之間等位基因上單堿基的重復(fù)數(shù)，可區(qū)分同一MLVA型的近緣分離株，從而更細(xì)致的反映細(xì)菌的遺傳進(jìn)化差異，SNR因此成為分子流行病學(xué)調(diào)查的有效技術(shù)手段，近年來被廣泛用于炭疽桿菌分型研究[2]。本研究采用SNR方法對來自貴州省2006-2016年間不同地區(qū)的炭疽芽胞桿菌進(jìn)行SNR分析，探討其SNR型別分布特征，為炭疽疫情監(jiān)測、調(diào)查與溯源提供技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 本研究所用菌株為本實(shí)驗(yàn)室2006-2016年間收集保存的貴州省各地區(qū)炭疽芽胞桿菌，共71株。其中5株來自患者標(biāo)本(4株分離自皮膚滲出物，1株分離自全血)，3株來自動(dòng)物標(biāo)本(狗肝、狗脾、病死牛肺各分離1株)，63株來自外環(huán)境標(biāo)本(2株分離自牲畜飲用水， 61株分離自土壤)。

1.2主要試劑 血瓊脂平板購自鄭州博賽公司，Taqmix聚合酶、滅菌去離子水、DNAMarker、瓊脂糖均購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 方 法

1.3.1炭疽桿菌基因組DNA的提取 將炭疽菌株接種于血平板培養(yǎng)18～24 h，挑取單菌落于0.2 mL無菌純水中制成菌懸液，100 ℃加熱 10 min，10 000 r/min離心 10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后備用。

1.3.2SNR位點(diǎn)引物設(shè)計(jì) 采用文獻(xiàn)[3]報(bào)道的4個(gè)SNR多態(tài)性位點(diǎn)(CL10、CL12、CL33、CL35)及其引物序列進(jìn)行SNR分析，引物序列委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技公司進(jìn)行引物合成。詳細(xì)引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息Tab.1 Information on primer sequences

1.3.3PCR擴(kuò)增 采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，體系包含Taqmix12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，去離子水9.5 μL。擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃變性2 min；94℃ 30 s、45℃ (CL12)30 s/ 50℃ (CL35)30 s/55℃ (CL10和CL33)30 s(各位點(diǎn)引物退火溫度不同)、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3.4毛細(xì)管電泳 將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)為清晰單一條帶后，委托北京天一輝遠(yuǎn)生物公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。本研究用3730xl測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得到原始圖譜(fsa文件)，使用GeneMapper v4.0軟件分析后生成PDF圖譜和Excel文檔(包括size、基因分型等信息)。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)過程中要作以下質(zhì)控：①對相同樣本進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)(2次重復(fù))并獲得一致的結(jié)果。②STR檢測結(jié)果峰值需達(dá)到400RFU，否則該標(biāo)本必須重新進(jìn)行檢測；③分析前檢查所有標(biāo)本內(nèi)標(biāo)是否正確；④每次實(shí)驗(yàn)必須同時(shí)做陰性對照和質(zhì)控陽性對照。

1.3.5SNR數(shù)據(jù)聚類分析 根據(jù)毛細(xì)管電泳所得本次所測71株菌株各SNR位點(diǎn)的序列長度，運(yùn)用Bionumerics7.6軟件進(jìn)行聚類分析，獲得SNR型別及構(gòu)建最小間距圖。

2 結(jié) 果

2.1炭疽芽胞桿菌SNR位點(diǎn)序列長度 71株貴州省炭疽芽胞桿菌菌株基因組DNA經(jīng)各SNR位點(diǎn)(CL10、CL12、CL33、CL35)引物擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳，獲得了菌株各SNR 位點(diǎn)的序列長度(表 2)。

表2 71株炭疽桿菌SNR位點(diǎn)序列長度Tab.2 Sequence lengths for SNRs of 71 Bacillus anthracis strains

2.2炭疽芽胞桿菌SNR數(shù)據(jù)聚類分析結(jié)果 基于SNR各位點(diǎn)序列長度的聚類分析顯示(圖1)，按照4個(gè)SNR位點(diǎn)基因完全相同定義為一個(gè)基因型，可以將71株菌分為37個(gè)SNR型，聚類圖中71株菌可分為A和B兩群，A群可進(jìn)一步分為A1和A2亞群，B群可進(jìn)一步分為B1和B2亞群，各亞群又可分為若干分支，其中A群有27個(gè)分支，B群有10個(gè)分支。71株菌中有26株分型為A2a,占全部菌株的36.62%，其次為A1a型，共有16株，占全部菌株的22.54%。菌株的聚類關(guān)系具有一定的地域性和時(shí)間聚集性。

圖1 71株炭疽桿菌SNR聚類分析Fig.1 Cluster analysis based on SNR data for 71 Bacillus anthracis strains

2.3炭疽芽胞桿菌SNR最小間距圖分析結(jié)果 基于炭疽芽胞桿菌SNR各位點(diǎn)序列長度的最小間距圖顯示，71株菌株被分別為7個(gè)SNR克隆群和6個(gè)單一的SNR型。大部分相同或相鄰區(qū)(縣)遺傳距離相對較近，但同時(shí)也存在不同區(qū)(縣)或年份來源菌株距離較近而相同縣來源菌株距離相隔較遠(yuǎn)的現(xiàn)象(圖2)。

圖2 71株炭疽桿菌SNR分型最小間距圖Fig.2 Minimum spanning tree based on SNR data for 71 Bacillus anthracis strains

3 討 論

貴州省炭疽疫源地分布廣泛，隨著居民生活水平的提高，近年來病例雖有所減少，但人間炭疽疫情時(shí)有發(fā)生，疫情高于全國平均水平[4-6]。由于炭疽桿菌可形成芽胞在疫源地土壤環(huán)境中可存活長達(dá)數(shù)十年，疫源地存在炭疽流行的風(fēng)險(xiǎn)，因此了解當(dāng)?shù)靥烤已堪麠U菌的分子型別特征對預(yù)防和控制當(dāng)?shù)靥烤乙咔榫哂兄匾饬x。

炭疽菌株遺傳信息具有極端的同源性，現(xiàn)有研究證明炭疽桿菌缺少分子的多樣性，質(zhì)粒電泳沒有差異，基因組AFLP、rRNA基因RFLP和保護(hù)性抗原的DNA序列差異非常小[7-8]。常用的脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型技術(shù)，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)技術(shù)僅能將炭疽芽胞桿菌同蠟狀芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌區(qū)分開來，即僅能鑒定到種屬間的差異[9-10]。多位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)方法被證明可用于鑒別炭疽菌株之間的差異及多樣性，是較好的分子分型方法之一，但僅能將不同的炭疽芽胞桿菌分離成不同的大基因組。單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析通過直接比較不同分離株基因組序列，找出單個(gè)堿基的差異，但也僅能分辨相似分離株，且操作繁瑣[2]。從自然暴發(fā)炭疽疫情和生物恐怖襲擊事件中獲得的炭疽分離株往往具有極低的基因多樣性，在這種需要區(qū)分遺傳進(jìn)化關(guān)系較近的分離株的情況下，MLVA 和 SNP 就不能滿足要求[2]。單核苷酸重復(fù)序列分析(SNR)是近年建立的分辨率更高的基因分型方法，Beyer等[3]選取了CL10、CL12、CL33和CL35共4個(gè)位點(diǎn)對384株分離菌進(jìn)行了研究，有效區(qū)分了同一MLVA基因型的不同菌株。

本研究利用4個(gè)SNR位點(diǎn)的單核苷酸重復(fù)序列分型方法將2006-2016年貴州省分離獲得的71株炭疽芽胞桿菌進(jìn)行SNR分型分析，了解貴州省近年來炭疽芽胞桿菌的SNR型別特征。SNR分析結(jié)果顯示，71株炭疽芽胞桿菌被分為37個(gè)SNR基因型。本文的聚類分析顯示，71株菌株可分為A和B兩群，A群可進(jìn)一步分為A1和A2亞群，B群可進(jìn)一步分為B1和B2亞群，各亞群又可分為若干分支，提示貴州省炭疽芽胞桿菌具有SNR型別多樣性。2006001和2006002菌株來源于同一只犬，被分為A2a亞群的同一基因型。71株菌株的聚類圖和最小間距圖均顯示菌株基因型分布具有一定的地域性和時(shí)間聚集性，而與菌株分離來源無明顯相關(guān)性，提示貴州省不同地區(qū)和不同年份間的流行菌株并非來源于同一克隆株。鑒于SNR分型技術(shù)具有更高分辨率的特點(diǎn)，SNR還能區(qū)分同一地區(qū)同一時(shí)間(同一疫情)的菌株。聚類分析顯示，分離自相同年份相同縣份同一疫情(2013年甕安縣)的7株菌株雖聚類較近，仍被分為2個(gè)不同的SNR基因型，而我們以往采用MLVA技術(shù)分型結(jié)果顯示這7株菌為同一MLVA基因型[11]。此外，2013年不同來源的2013001、2013003、2013006和2013007菌株聚類較近，2006年來自患者的200604菌株與來自土壤的200606菌株聚類較近，提示來自相同年份和地區(qū)(縣)的環(huán)境(土壤)或動(dòng)物來源菌株與患者來源菌株聚類較近，反應(yīng)了當(dāng)時(shí)引起人間炭疽疫情的菌株的可能來源。

綜上所述，本研究應(yīng)用基于4個(gè)位點(diǎn)的SNR技術(shù)對貴州省2006-2016年間分離的71株炭疽芽胞桿菌進(jìn)行SNR分型分析，結(jié)果提示貴州省近年來的炭疽芽胞桿菌具有SNR型別多樣性，且SNR型別分布具有一定的地域和時(shí)間聚集性的分布特點(diǎn)，結(jié)果反映了不同地區(qū)來源菌株的復(fù)雜性。通過SNR技術(shù)可進(jìn)一步了解貴州省菌株的遺傳與進(jìn)化關(guān)系，揭示貴州省炭疽芽胞桿菌的基因型別和分子流行病學(xué)特征，為當(dāng)?shù)靥烤乙咔榈念A(yù)警和防控提供病原學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無