謝佳燕 顏淵 楊鈺慧 閆達中 吳菁

摘要：【目的】明確不同水域黃河高原鰍群體免疫基因多樣性水平和遺傳組成，為黃河高原鰍自然種質(zhì)資源現(xiàn)狀的評估、保護及合理開發(fā)提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎杉S河中上游不同河段的黃河高原鰍自然群體[青海循化（XH）群體、青海大通（DT）群體及甘肅景泰（JT）群體]樣品，基于重組激活基因（Rag1）序列對不同黃河高原鰍群體的遺傳多樣性水平和遺傳組成差異進行研究?！窘Y(jié)果】在不同黃河高原鰍群體的Rag1基因序列中共檢測到8個單倍型（H1～H8），其中有5個單倍型（H1、H2、H3、H4和H6）在2個以上的群體間相互共享，尤其是單倍型H1、H4和H6在所有群體中均有分布。黃河高原鰍總?cè)后w的單倍型多態(tài)性為0.742，核苷酸多態(tài)性為0.003，在3個黃河高原鰍群體中共檢測到28個多態(tài)位點。不同黃河高原鰍種群間的單倍型多態(tài)性范圍在0.575～0.872，核苷酸多態(tài)性范圍在0.002～0.003。XH群體與JT群體間的遺傳分化系數(shù)（Fst）為0.037，XH群體與DT群體間的Fst為-0.041，JT群體與DT群體的Fst為-0.022;不同黃河高原鰍群體的分子遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)（占99.56%）。單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖及NJ聚類樹和ML聚類樹均顯示，不同黃河高原鰍自然種群個體相互混合在一起，未按照采樣河段地理位置形成明顯的聚類結(jié)構(gòu)，即黃河高原鰍不同單倍型間呈現(xiàn)混合的分布格局?！窘Y(jié)論】黃河高原鰍群體遺傳多樣性水平中等，不同自然群體間的遺傳多樣性水平存在一定差異，但并未檢測到顯著的遺傳差異，建議在野外進行管理和保護時仍可視為一個整體。

關(guān)鍵詞： 黃河高原鰍;Rag1基因;自然種群;遺傳結(jié)構(gòu);單倍型

中圖分類號： S965.199? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）12-3237-07

Genetic structure of Triplophysa pappenheimi populations

based on Rag1 gene sequence

XIE Jia-yan， YAN Yuan， YANG Yu-hui， YAN Da-zhong， WU Jing

（School of Life Science and Technology， Wuhan Polytechnic University， Wuhan? 430023， China）

Abstract：【Objective】Studying the population immune gene diversity and genetic structure could effectively assess the current status， and provide a theoretical basis for conservation and rational exploitation of the wild resources of Triplophysa pappenheimi. 【Method】The genetic diversity and structure of the natural populations of T. pappenheimi， sampled from different reaches of the middle and upper reaches of the Yellow River， Xunhua （XH） and Datong （DT） in Qinghai Province， and Jingtai （JT） in Gansu Province， were analyzed by using the recombination activating gene 1 （Rag1） sequences. 【Result】Eight unique haplotypes （H1-H8）? were identified in Rag1 sequence from all individuals of T. pappenheimi. Five haplotypes （H1， H2， H3， H4 and H6） shared between any two of populations， and three of them （H1， H4 and H6） shared among all populations. The haplotype and nucleotide diversities of T. pappenheimi were 0.742 and 0.003， respectively. Twenty eight polymorphic sites were detected in three populations. Haplotype diversity ranged from 0.575 to 0.872 and nucleotide diversity ranged from 0.002 to 0.003 among populations. The genetic differentiation coefficient（Fst） value between XH and JT， between XH and DT， and between JT and DT were 0.037， -0.041， and -0.022， respectively. The molecular variation analysis （AMOVA） revealed high genetic variation within populations （99.56%）. Both NJ and ML phylogenetic tree and haplotype network analysis showed that individuals from different populations were mixed together and did not form obvious cluster according to phylogeographic structure. Mixed distribution patterns were presen-ted between the different haplotypes in T. pappenheimi. 【Conclusion】It is suggested that these natural populations of T. pappenheimi have the middle level of genetic diversity. Different levels of genetic diversity are found among these wild populations. Moreover， it is not obviously identified genetic divergence among the populations of T. pappenheimi. It is suggested that management and conservation of these populations in the field can be regarded as a whole.

Key words： Triplophysa pappenheimi; Rag1 gene; wild population; genetic structure; haplotype

Foundation item： State Foundation for Studying Abroad（201808420365）; Collaborative Education Project of Industry University Cooperation of the Ministry of Education （202102102111）; Scientific Research Project of Education Department of Hubei （B2017076）

0 引言

【研究意義】高原鰍屬（Triplophysa）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）條鰍科（Nemacheilinae），是適應(yīng)于高原高寒及高海拔環(huán)境的青藏高原主體魚類群體（陳宜瑜，1998）。高原鰍屬魚類是鯉形目中物種最豐富的屬，目前記錄有近150個有效種，我國分布有126個種（He et al.，2020），主要分布在青藏高原及其鄰近地區(qū)的河流或湖泊。高原魚類的起源及演化與青藏高原形成過程中導(dǎo)致周邊氣候環(huán)境的激烈演變密切相關(guān)（何德奎等，2006;He et al.，2016;Feng et al.，2019）。因此，系統(tǒng)開展高原鰍屬魚類的進化及其適應(yīng)性研究，對挖掘高原生物多樣性的起源問題具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】黃河為我國的第二大河流，分布有淡水魚類物種165種（He et al.，2020），其上游魚類區(qū)系以高原魚類為主（陳宜瑜，1998）。然而，隨著人類活動的加劇及外來物種的快速入侵等，致使水體生態(tài)環(huán)境日益遭到破壞，黃河上游魚類生物多樣性正面臨著持續(xù)喪失的威脅，許多魚類資源逐漸衰竭，且瀕危程度和范圍不斷加?。ㄈ爿x軍等，2010;Xie et al.，2018）。黃河高原鰍[T. pappenheimi （Fang，1935）]是高原鰍屬中體型較大的條鰍科物種，主要分布在蘭州以上黃河上游的干支流激流河段及其附屬湖泊，是適應(yīng)于高原季節(jié)極端性寒冷環(huán)境的代表性魚類種群之一（朱松泉，1989）。目前，黃河高原鰍已被列入《中國脊椎動物紅色名錄》，屬于瀕危魚類（Endangered，EN）（曹亮等，2016;蔣志剛等，2016），已陸續(xù)在黃河上中游設(shè)立3個國家級自然保護區(qū)及3個國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)，重點保護包括黃河高原鰍在內(nèi)的黃河上游特有魚類（水利部黃河水利委員會，2007）;同時在龍羊峽下游建設(shè)有2個魚類增殖站，對黃河特有魚類物種種群數(shù)量的維持和增長具有重要意義（洪歡，2016）。移植馴化、人工繁育和增殖放流等是進行種質(zhì)資源保護的重要措施，但人工增殖放流物種或個體是否對自然種群的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進而導(dǎo)致不同地理種群遺傳結(jié)構(gòu)同質(zhì)化，是種群補充過程中必須密切關(guān)注的問題。因此，在人工增殖放流前對自然種群遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)進行深入研究，有助于指導(dǎo)選擇人工繁殖親魚來源和放流河段，評估增殖放流對物種或種群遺傳多樣性的影響，提高對瀕危物種的有效保護效果（楊君興等，2013）。重組激活基因（Recombination activating genes，RAGs）普遍存在于脊椎動物的核基因組中，是脊椎動物受異原物質(zhì)刺激后進行特異性免疫響應(yīng)的主要基因（Schatz et al.，1989），現(xiàn)已發(fā)展成為研究動物遺傳進化和遺傳多樣性的典型核基因分子標記（Yu et al.，2014;Hague and Routman，2016;Silva-Santos et al.，2018）。方冬冬等（2018）基于Rag2基因探討淮河源區(qū)[]（Hemiculter leucisculus）種群遺傳多樣性及其群體遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)由于近期群體擴張和頻繁的基因交流，導(dǎo)致淮河源區(qū)[]群體間尚未形成明顯的遺傳結(jié)構(gòu)和譜系格局。Eldridge等（2018）基于Rag 1基因評估蘇拉威西島特有鼩鼱（Crocidura elongata）的遺傳結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的鼩鼱種群具有較高的遺傳多樣性，其多樣性結(jié)構(gòu)的形成與特有地區(qū)領(lǐng)域邊界、海拔高度及領(lǐng)域內(nèi)的地理隔離有關(guān)。Wu等（2019）基于Rag1基因分析香港異鱲（Parazacco spilurus）的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)相鄰水域中具有2個高度分歧的譜系，且譜系間的分歧超過了鯉科近緣屬間的物種分化，即這2個譜系可能代表2個不同的物種?！颈狙芯壳腥朦c】至今，有關(guān)黃河高原鰍的研究主要涉及其物種訂正及系統(tǒng)發(fā)育進化分析等領(lǐng)域（何德奎等，2006;Wang et al.，2016;Li et al.，2017;Feng et al.，2019），而針對其自然種群遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)分析的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采集黃河中上游不同河段的黃河高原鰍自然群體樣品，通過測定其Rag1基因序列，分析不同河段黃河高原鰍群體免疫基因多樣性水平和遺傳組成，以期為黃河高原鰍自然種質(zhì)資源現(xiàn)狀的評估、保護及合理開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣本采集

黃河高原鰍樣本分別采自黃河流域的青海和甘肅河段，共3個群體[青海循化（XH）群體、青海大通（DT）群體及甘肅景泰（JT）群體]。收集黃河高原鰍個體的新鮮肌肉樣品置于95%乙醇中固定，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 黃河高原鰍Rag1基因克隆及測序分析

采用標準酚—氯仿法提取黃河高原鰍基因組DNA，然后參照Li和Ortí（2007）的方法，利用引物RAG1-2510F和RAG1-4063R擴增黃河高原鰍Rag1基因序列。PCR擴增體系50.0 μL：10×PCR擴增緩沖液5.0 μL，dNTP（200 μmol/L）1.0 μL，上、下游引物（0.15 μmol/L）各0.75 μL，DNA模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.6 μL，三蒸水補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 50 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，送至武漢艾康健生物科技有限公司進行測序。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX 1.83和SeaView分別對黃河高原鰍Rag1基因序列進行比對分析（Thompson et al.，1997）;利用DnaSP v5進行單倍型識別（Librado and Rozas，2009）;運用Arlequin 3.5程序包完成群體遺傳多樣性、遺傳距離和基因流計算及分子變異方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）（Excoffier and Lischer，2010）;采用Network 10.1以Median-joining法構(gòu)建不同黃河高原鰍單倍型間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖（Bandelt et al.，1999）。從GenBank下載條鰍科北方須鰍（Barbatula barbatula，EU711107）、背紋南鰍（Schistura balteata，EU711131）及長尾軟鰭條鰍（Paracobitis longicauda，EU711124）的Rag基因序列，并與黃河高原鰍Rag1基因序列進行多序列比對分析;基于Kimuras 2-parameter模型，采用MEGA 6.0構(gòu)建黃河高原鰍不同單倍型的NJ（Neighbor-joining）聚類樹和ML（Maximum-likelihood）聚類樹（Tamura et al.，2013），其置信度采用Bootstrap為1000次進行重復(fù)檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黃河高原鰍Rag1基因的核苷酸組成特點

對黃河高原鰍樣本的Rag1基因序列進行比對分析，結(jié)果獲得Rag1基因外顯子長度為1485 bp的同源序列。在3個黃河高原鰍群體45個樣本中共檢測到28個多態(tài)性位點（表1），包括16個堿基轉(zhuǎn)換位點和12個堿基顛換位點;Rag1基因序列中無堿基插入或缺失現(xiàn)象。黃河高原鰍Rag1基因序列中堿基A、T、G和C的含量無明顯差異，分別為24.8%、22.7%、28.1%和24.4%。

2. 2 黃河高原鰍單倍型及群體遺傳多樣性

對黃河高原鰍Rag1基因進行PCR擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均獲得清晰單一的目的基因條帶（圖1），測序后進行比對分析共識別到8個Rag1基因序列單倍型（表2），其中，有3個單倍型（H5、H7和H8）為單個種群所特有（占11.6%），其余5個單倍型出現(xiàn)在黃河高原鰍的不同種群中。單倍型H1、H4和H6在所有黃河高原鰍群體中均有分布，占76.7%，且單倍型H6的數(shù)目占總個體數(shù)的46.5%。由單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖（圖2）可看出，除單倍型H8外，黃河高原鰍Rag1基因的所有單倍型均以單倍型H3為中心和起點，呈星狀分布態(tài)勢或進化形成新的不同分支。黃河高原鰍Rag1基因不同單倍型間的變異步數(shù)分別為1～4步，表明黃河高原鰍各單倍型并未依據(jù)采樣河段的地理位置而形成獨立分支。

對黃河高原鰍不同群體Rag1基因的遺傳多樣性水平進行檢測，結(jié)果表明，黃河高原鰍總?cè)后w的單倍型多態(tài)性為0.742，核苷酸多態(tài)性為0.003。不同黃河高原鰍群體的遺傳多樣性呈中等水平，其種群間的單倍型多態(tài)性范圍在0.575～0.872，核苷酸多態(tài)性范圍在0.002～0.003（表2）。其中，JT群體的單倍型多態(tài)性明顯高于其余2個黃河高原鰍群體，但其核苷酸多態(tài)性在不同群體中基本相似。

2. 3 黃河高原鰍群體遺傳結(jié)構(gòu)

運用Arlequin 3.5程序包對不同黃河高原鰍群體進行群體遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，XH群體與JT群體間的遺傳分化系數(shù)（Fst）為0.037，XH群體與DT群體間的Fst為-0.041，JT群體與DT群體的Fst為 -0.022。經(jīng)Global test檢測發(fā)現(xiàn)，僅JT群體和DT群體間存在顯著差異（P<0.05）。對不同黃河高原鰍群體間的基因流進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整個自然群體的基因流為17.79。AMOVA分析結(jié)果也表明，不同黃河高原鰍群體的分子遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)，占99.56%。

2. 4 黃河高原鰍單倍型聚類分析結(jié)果

基于Kimuras 2-parameter模型，以北方須鰍（EU711107）、背紋南鰍（EU711131）及長尾軟鰭條鰍（EU711124）的Rag基因序列為外群，構(gòu)建不同黃河高原鰍群體Rag1基因單倍型的NJ聚類樹和ML聚類樹，結(jié)果顯示構(gòu)建獲得的NJ聚類樹（圖3）和ML聚類樹（圖4）基本一致，黃河高原鰍與北方須鰍、背紋南鰍及長尾軟鰭條鰍的親緣關(guān)系均較遠。不論是在NJ聚類樹還是在ML聚類樹中，3個黃河高原鰍群體的8個單倍型均先聚類成獨立分支，然后與北方須鰍聚類成一支，而背紋南鰍與長尾軟鰭條鰍聚類成另一分支。黃河高原鰍不同單倍型間呈現(xiàn)混合的分布格局，其中單倍型H8在NJ聚類樹和ML聚類樹中均位于所有高原鰍單倍型分支的最底部，且未發(fā)現(xiàn)黃河高原鰍單倍型與采樣地點對應(yīng)的分支，與單倍型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖相似。

3 討論

物種個體間的遺傳多態(tài)性能為其適應(yīng)環(huán)境改變的生命進化過程提供主要的多態(tài)性來源，可同時反映并影響物種、群落及生態(tài)系統(tǒng)等更高組織水平的多態(tài)性過程（Frankham，2005），因此，遺傳多樣性也被認為是監(jiān)測生物圈完整性所必需、最基本的生物多樣性變量（Steffen et al.，2015）。種內(nèi)遺傳多樣性的保持有助于物種繁衍和維持整個生態(tài)系統(tǒng)多樣性，而遺傳均質(zhì)化或多樣性貧乏將威脅物種或群體的持續(xù)生存（Frankham，2005）。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是評價遺傳多樣性水平的2個重要參數(shù)，其閾值分別為0.5和0.005（Grant and Bowen，1998）。本研究基于Rag1基因序列對黃河高原鰍群體樣本進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，黃河高原鰍總?cè)后w的單倍型多態(tài)性為0.742，核苷酸多態(tài)性為0.003，其遺傳多樣性水平并不高，可能與近年來黃河流域生境遭到破壞、水體污染嚴重及過度捕撈等因素致使天然水域中黃河高原鰍資源嚴重衰退有關(guān)（茹輝軍等，2010;唐文家和何德奎，2013）。在自然水體中黃河高原鰍種群已萎縮或呈破碎化，種群數(shù)量極速下降，而改善黃河高原鰍的生境是維持其種群遺傳多樣性高水平的有效措施。

雖然在天然水域中黃河高原鰍種群數(shù)量萎縮明顯，但本研究的AMOVA分析結(jié)果表明黃河高原鰍的分子遺傳變異主要來自群體內(nèi)（占99.56%），群體間的Fst為-0.041～0.037，僅JT群體與DT群體間存在顯著差異;黃河高原鰍不同單倍型間呈現(xiàn)混合的分布格局，群體間共享單倍型所占比例較高（88.4%），不同高原鰍群體間仍保持一定的基因交流。棲息地流域上中游間的相互連通，也可能促進水系流域上下游不同高原鰍群體間的相互交流，進而削弱因地理隔離導(dǎo)致的群體間差異，致使不同黃河高原鰍群體間未檢測到明顯的單倍型地理分布格局。近年來，黃河干支流上已完成多處梯級水利設(shè)施的大規(guī)模構(gòu)建，且在上游已規(guī)劃構(gòu)建多個級聯(lián)水壩，致使急流水體逐漸向靜水水體過渡，而水文條件的改變可加速破壞水體生境原有的異質(zhì)性，影響上游群體與干流中下游群體間的雙向遷移和基因交流，從而加速河流棲息地水生物種群體間的地理隔離和片段化，促使種群間的遺傳差異相互積累（唐文家和何德奎，2013;Xie et al.，2018）。本研究未檢測到不同黃河高原鰍群體間存在明顯的遺傳差異，可能是當前棲息地河段中已建成或蓄水大壩的構(gòu)建時間較短，尚未對大壩上、下游河段中的種群基因交流產(chǎn)生明顯阻隔所致。但已有研究證實，級聯(lián)水利設(shè)施的構(gòu)建易促使河流魚類區(qū)系中土著魚類與外來魚種的組成發(fā)生明顯變化，且?guī)靺^(qū)上、下游河段中的總體物種遺傳多樣性水平下降（茹輝軍等，2010;楊成等，2011;Xie et al.，2018）。因此，開展地區(qū)土著魚類遺傳多樣性水平的長期研究，鑒別其自然種群中的關(guān)鍵遺傳單元（Critical genetic units），對有效保護瀕危土著魚類物種具有重要意義。

4 結(jié)論

黃河高原鰍群體遺傳多樣性水平中等，不同自然群體間的遺傳多樣性水平存在一定差異，但并未檢測到顯著的遺傳差異，建議在野外進行管理和保護時仍可視為一個整體。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）