段迎 楊曉琳 蔡蘇云 賀潤(rùn)麗 尹桂芳 王艷青 盧文潔 孫道旺 王莉花

摘要：【目的】克隆苦蕎肉桂醇脫氫酶（CAD）基因并分析其組織表達(dá)特性，為深入研究CAD基因在苦蕎果殼形成中的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā炕诳嗍w轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從苦蕎厚果殼品種云蕎1號(hào)和薄果殼品種小米蕎克隆CAD基因，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)CAD基因在不同果殼厚度類(lèi)型（厚果殼苦蕎和薄果殼苦蕎）不同組織的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】從薄果殼苦蕎和厚果殼苦蕎中均克隆獲得2條苦蕎CAD基因，且這2條基因序列在薄果殼苦蕎與厚果殼苦蕎中均完全一致，命名為FtCAD-1和FtCAD-2。FtCAD-1基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為876 bp，編碼291個(gè)氨基酸殘基，為疏水性的穩(wěn)定酸性蛋白，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì);FtCAD-2基因的ORF長(zhǎng)度為1083 bp，編碼360個(gè)氨基酸殘基，為親水性的穩(wěn)定酸性蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)。FtCAD-1和FtCAD-2蛋白均具有CAD蛋白3個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域，且不具有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。FtCAD-1與數(shù)據(jù)庫(kù)目標(biāo)蛋白2cf5.1.B的結(jié)構(gòu)相似度為74.74%，而FtCAD-2與數(shù)據(jù)庫(kù)目標(biāo)蛋白5z0c.1.A的結(jié)構(gòu)相似度為63.03%。FtCAD-1與擬南芥的第一類(lèi)CAD蛋白（AtCAD4和AtCAD5）的親緣關(guān)系較近;FtCAD-2與擬南芥的第二類(lèi)CAD蛋白（AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6等）的親緣關(guān)系較近。FtCAD-1和FtCAD-2基因均在種仁中的相對(duì)表達(dá)量最高，且厚果殼苦蕎與薄果殼苦蕎間無(wú)顯著差異（P>0.05）。FtCAD-1基因在厚果殼苦蕎葉、花和果殼中的相對(duì)表達(dá)量顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01）高于薄果殼苦蕎，尤其是在厚果殼苦蕎果殼中相對(duì)表達(dá)量是薄果殼苦蕎的16倍。FtCAD-2基因除了在薄果殼苦蕎果殼中相對(duì)表達(dá)量顯著高于厚果殼苦蕎外，在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)為厚果殼苦蕎高于薄果殼苦蕎?！窘Y(jié)論】FtCAD-1屬于第一類(lèi)CAD基因，具有明顯的組織表達(dá)特異性，推測(cè)其在苦蕎木質(zhì)素生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 苦蕎;肉桂醇脫氫酶（CAD）;RT-PCR克隆;生物信息學(xué)分析;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)： S517.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3340-10

Cloning and tissue expression analysis of FtCAD-1 and FtCAD-2 genes from tartary buckwheat

DUAN Ying1， YANG Xiao-lin1， CAI Su-yun1， HE Run-li1*， YIN Gui-fang2，

WANG Yan-qing2， LU Wen-jie2， SUN Dao-wang2， WANG Li-hua2*

（1School of Traditional Chinese Medicine and Food Engineering，Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan? 030619， China; 2Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Biotechnology and Genetic Germplasm Resources Research Institutes/Yunnan Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology/Key Laboratory of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】To clone the cinnamyl alcohol dehydrogenase（CAD） gene of tartary buckwheat and analyze its tissue expression characteristics， in order to provide a theoretical reference for further study of the molecular mechanism underlying CAD gene regulation during the formation of the thin husk of tartary buckwheat. 【Method】The CAD gene of tartary buckwheat with thin husk （Yunqiao 1） and tartary buckwheat with thick husk （rice buckwheat） was cloned based on the related fragments of tartary buckwheat transcriptome and analyzed by bioinformatics. The expression of CAD in different tissues of the different husk types（thin husk and thick husk） was studied by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】Two CAD genes of tartary buckwheat were cloned from tartary buckwheat with thin and thick husks，and found to be completely identical to FtCAD-1 and FtCAD-2. The open reading frame（ORF） of FtCAD-1 gene was 876 bp in length and encoded 291 amino acid residues. It was predicted to be a hydrophobic stable acidic protein and was located in the nucleus and cytoplasm. The ORF of FtCAD-2 gene was 1083 bp in length and encoded 360 amino acid residues predicted to be a hydrophilic and stable acidic protein located in the cytoplasm. Both proteins had three typical conserved domains of CAD proteins，but did not have transmembrane domains or signal peptides， and so belong to non-secreted proteins. The structural similarity between FtCAD-1 and the database target protein 2cf5.1.B was 74.74%， while the structural similarity between FtCAD-2 and the database target protein 5z0c.1.A was 63.03%. FtCAD-1 was closely related to the first type of protein （AtCAD4， AtCAD5） in Arabidopsis lignin synthesis， but FtCAD-2 was closely related to the second type of CAD protein （AtCAD2， AtCAD3， AtCAD6 et al.） in Arabidopsis. The relative expression levels of FtCAD-1 and FtCAD-2 genes were the highest in the seed kernels， where there was no significant difference observed between the thick-husk and the thin-husk tartary buckwheat types（P>0.05）. The relative expression of FtCAD-1 gene in the leaves，flowers and husks of tartary buckwheat with thick husks was significantly （P<0.05， the same below） or very significantly （P<0.01） higher than those in tartary buckwheat with thin husks. This was most notable in the husks，where the relative expression level of FtCAD-1 thick husked tartary buckwheat was 16 times higher than that in tartary buckwheat with thin husk. In contrast，the relative expression level of the FtCAD-2 gene was significantly higher in thin husks than that in thick husks， while in other tissues FtCAD-1 showed a higher relative expression level in thick husked tartary buckwheat than that in thin husked tartary buckwheat. 【Conclusion】The FtCAD-1 gene belongs to the first type of CAD gene， it has tissue expression specificityand plays an important role in the regulation of lignin biosynthesis in tartary buckwheat.

Key words：tartary buckwheat; cinnamyl alcohol dehydrogenase（CAD）; RT-PCR cloning; bioinformatics analysis; real-time fluorescence quantitative PCR

Foundation item： Construction Project National Technical System of Oat and Buckwheat Industry（CARS-07-C-2）;Key Research and Development Project of Shanxi（201803D221012-6）; Shanxi Province Natural Science Research General Project（20210302123231）

0 引言

【研究意義】苦蕎[Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn]具有利耳目、續(xù)精神、益氣力等功效，是我國(guó)藥食同源文化的典型體現(xiàn)（王世霞等，2016;周良等，2019）?？嗍w果殼較厚，殼比率可達(dá)20%～30%，果殼十分堅(jiān)韌，脫殼困難，從而難以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)整粒的苦蕎米，無(wú)法高效獲得具有高蘆丁含量的麩皮層全營(yíng)養(yǎng)苦蕎米，很大程度上降低了苦蕎米的營(yíng)養(yǎng)功效（陳慶富等，2015）。研究發(fā)現(xiàn)，薄果殼苦蕎的果殼木質(zhì)素含量較厚果殼苦蕎低（吳朝昕等，2020），更受人們的青睞。雖然目前關(guān)于苦蕎薄果殼形成的原因尚不清楚，但研究證實(shí)肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素特異合成途徑中最后一步的催化酶，在木質(zhì)素生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，克隆苦蕎CAD基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)探究CAD在苦蕎薄果殼形成的作用機(jī)制及培育薄果殼苦蕎均具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CAD屬于NADPH依賴(lài)性酶家族，含有CAD蛋白家族的甘氨酸NADP（H）輔酶結(jié)構(gòu)域GLGGV（L）G及2個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)：GHE（X）2G（X）5G（X）2V和GD（X）9，10C（X）2C（X）2C（X）7C（Chao et al.，2014）。自Knight等（1992）首次從煙草莖部克隆獲得CAD基因以來(lái)，陸續(xù)從番薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]（Kim et al.，2010）、馬尾松[Pinus massoniana Lamb.]（張逢凱等，2014）、高梁（Sorghum vulgare Pers.）（王麗華等，2015）、香椿[Toona sinensis （A. Juss.） Roem.]（隋娟娟等，2019）等多種植物中克隆獲得。韓國(guó)粉（2014）通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出軟核山楂與硬核山楂間的差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAD基因在軟核山楂果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量較硬核山楂顯著下調(diào)。龔凌燕（2014）對(duì)不同石榴品種的籽粒中PgCAD基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PgCAD基因在紅玉石籽、白玉石籽、粉皮、會(huì)理軟籽和蒙自甜石榴4個(gè)石榴品種籽粒中的相對(duì)表達(dá)量與籽粒種皮總木質(zhì)素含量呈正相關(guān)。張穎?。?015）研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下油菜CAD基因表達(dá)水平與莖稈和根系中的木質(zhì)素含量均呈顯著正相關(guān)。可見(jiàn)，CAD基因在木質(zhì)素生物合成過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控功能，將芥子醛、松柏醛和香豆醛催化還原成木質(zhì)素單體的前體物質(zhì)芥子醇、松柏醇和香豆醇（Pandey et al.，2011）。近年來(lái)，從苦蕎克隆獲得的基因主要包括查爾酮合成酶基因（FtCHS1和FtCHS2）（孫朝霞等，2014）、類(lèi)黃酮3′-羥化酶基因（FtF3′H）（李雙江等，2014）、4-香豆酸輔酶A連接酶基因（Ft4CL）（凌瑤等，2015）、肉桂酸-4-羥基化酶基因（C4H）（劉榮華等，2017）等，其中大部分基因?qū)儆邳S酮生物合成支路，而在木質(zhì)素生物合成支路的基因研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期對(duì)厚果殼品種云蕎1號(hào)和薄果殼品種小米蕎進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因在云蕎1號(hào)的表達(dá)量高于小米蕎，說(shuō)明這些基因在苦蕎果殼形成過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。但對(duì)于這些基因的克隆及表達(dá)分析等相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于前期苦蕎轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，克隆厚果殼苦蕎品種云蕎1號(hào)和薄果殼苦蕎品種小米蕎的CAD基因（FtCAD-1和FtCAD-2），對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)CAD基因在不同果殼類(lèi)型苦蕎不同組織的表達(dá)模式，為研究苦蕎薄果殼形成的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的薄果殼品種小米蕎為云南地方品種。供試的苦蕎厚果殼品種云蕎1號(hào)為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所選育品種。分別取2個(gè)供試品種不同發(fā)育期的果實(shí)，剝離果殼，按品種混合在一起作為基因克隆材料。采用云蕎1號(hào)和小米蕎結(jié)實(shí)期的葉、花、莖、果殼和種仁等不同組織用于qRT-PCR檢測(cè)檢測(cè)。主要試劑：Trizol提取試劑盒（B511321）、柱式DNA膠回收試劑盒（B518131）、M-MuLV Reverse Transcriptase和RNase H（B500517）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;TaKaRa LA Taq（DRR02AG）、瓊脂糖B（BBI，A600014）、4S Red Plus 核酸染色劑（10000×水溶液，BBI，A606695）、2×SG Fast qPCR Master Mix（BBI，B639271）等。主要儀器設(shè)備：PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（加拿大，BBI）、YXJ-2離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）、SW-CJ-1D潔凈工作臺(tái)（江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠）、FR980凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）、U-3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Hitachi）、SMA4000微量分光光度計(jì)（Merinton Instrument，Inc）、HC-2518R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳儀器有限公司）和LightCycler480型熒光定量PCR儀（Rotkreuz，Switzerland）等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 總RNA提取及cDNA合成 利用Trizol提取試劑盒提取云蕎1號(hào)和小米蕎不同發(fā)育期的果殼混合材料的總RNA，并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。采用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 2. 2 基因克隆 基于苦蕎轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，根據(jù)CAD基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物（表1）。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.5 μL，40 ng/μL的DNA模板1.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，雙蒸餾水補(bǔ)充至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，再和用柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收純化，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 2. 3 生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的ORFfinder和Conserved domains對(duì)開(kāi)放閱讀框（ORF）及保守功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過(guò)ProtParam對(duì)蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析;利用ProtScale對(duì)蛋白的親疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過(guò)TMHMM Server v.2.0、SignalP 5.0 Server、NetPhos 3.1 Server和Psort對(duì)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用SOPMA和SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用DNAMAN 9.0對(duì)GenBank中的同源蛋白進(jìn)行氨基酸序列多重序列比對(duì)分析。同時(shí)，采用MEGA 6.0的鄰接法構(gòu)建不同物種CAD蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 2. 4 qRT-PCR檢測(cè) 采用Trizol總RNA抽提試劑盒分別提取厚果殼和薄果殼苦蕎的不同組織（葉、花、莖、果殼和種仁）總RNA，并利用Maxima Reverse Transcriptase試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系：2×SG Fast qPCR Master Mix 10.0 μL，10 μmol/L上、下引物（表1）各0.4 μL，40 ng/μL cDNA模板2.0 μL，雙蒸餾水補(bǔ)充至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。以苦蕎基因H3為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA提取及基因克隆結(jié)果

分別提取云蕎1號(hào)和小米蕎不同發(fā)育期的果殼混合材料總RNA，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）顯示，RNA條帶清晰可見(jiàn)，28S RNA和18S RNA亮度比為1∶1～2∶1，表明RNA基本未降解，可用于基因克隆。利用RT-PCR均從薄果殼苦蕎和厚果殼苦蕎中克隆獲得2條片段，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，2條片段的大小約1000 bp（圖2）。對(duì)這2條片段進(jìn)行回收測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2條CAD基因序列在薄果殼苦蕎與厚果殼苦蕎中均完全一致，命名為FtCAD-1（GenBank登錄號(hào)：MW455112）和FtCAD-2（GenBank登錄號(hào)：MW455113）。FtCAD-1基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為876 bp，編碼291個(gè)氨基酸殘基;FtCAD-2基因的ORF長(zhǎng)度為1083 bp，編碼360個(gè)氨基酸殘基（圖3）。

2. 2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 2. 1 理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析結(jié)果 ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)tCAD-1蛋白的分子式C1401H2238N372O416S15，理論分子量31430.33 Da，理論等電點(diǎn)（pI）6.14，親水性平均系數(shù)0.093，不穩(wěn)定系數(shù)35.00，為疏水性的穩(wěn)定酸性蛋白;FtCAD-2蛋白的分子式C1743H2759N465O515S21，理論分子量39142.15 Da，pI 6.75，親水性平均系數(shù)-0.036，不穩(wěn)定系數(shù)25.52，為親水性的穩(wěn)定酸性蛋白（表2）。ProtScale預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)tCAD-1蛋白的最高分值（2.278）出現(xiàn)在多肽鏈中的第211位氨基酸，說(shuō)明該氨基酸疏水性最強(qiáng);最低分值（-2.678）出現(xiàn)在多肽鏈中的第49位氨基酸，說(shuō)明該氨基酸親水性最強(qiáng)。FtCAD-2蛋白的最高分值（2.100）出現(xiàn)在多肽鏈中的第98位氨基酸，說(shuō)明該氨基酸疏水性最強(qiáng);最低分值（-3.211）出現(xiàn)在多肽鏈中的第35位氨基酸，說(shuō)明該氨基酸親水性最強(qiáng)。NetPhos3.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)tCAD-1蛋白的磷酸化位點(diǎn)共有27個(gè)，其中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸分別為14、9和4個(gè);FtCAD-2蛋白的磷酸化位點(diǎn)有30個(gè)，其中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸分別為16、12和2個(gè)。推測(cè)這些位點(diǎn)氨基酸發(fā)生磷酸化反應(yīng)，從而對(duì)FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的活性和生物學(xué)功能發(fā)生調(diào)控作用。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)tCAD-1和FtCAD-2蛋白均不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。SignalP 5.0 Server預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)tCAD-1和FtCAD-2蛋白均不具有信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。Psort預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)tCAD-1主要分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中;FtCAD-2主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。

2. 2. 2 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析結(jié)果 對(duì)FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（Conserved domains）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)tCAD-1屬于PLNO2514超基因家族，F(xiàn)tCAD-2屬于PLNO2586超基因家族（圖4）。

2. 2. 3 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)SOPMA對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FtCAD-1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲（占37.80%）、α-螺旋（占26.46%）、延伸鏈（占25.77%）和β-折疊（占9.97%）;FtCAD-2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲（占44.44%）、α-螺旋（占23.89%）、延伸鏈（占24.72%）和β-折疊（占6.94%）（圖5）組成。FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示。FtCAD-1蛋白與數(shù)據(jù)庫(kù)目標(biāo)蛋白2cf5.1.B的結(jié)構(gòu)相似度為74.74%，QMEAN值為-1.22，GMQE值為0.85，說(shuō)明建模可信度較高。FtCAD-2蛋白與數(shù)據(jù)庫(kù)目標(biāo)蛋白5z0c.1.A的結(jié)構(gòu)相似度為63.03%，QMEAN值為-0.87，GMQE值為0.82，說(shuō)明建模可信度較高。

2. 2. 4 氨基酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTp搜索FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的同源序列，結(jié)果顯示，F(xiàn)tCAD-1蛋白與GenBank中的同源序列包括蕪青（Brassica rapa L，XP—009101881.2）、歐洲油菜（B. napus L，XP—013644950.1）、番茄（Solanum lycopersicum L，XP—004235066.2）、麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas L，XP—012075299.1）、澳洲棉（Gossypium australe，KAA345 7323.1）、橡膠樹(shù)[Hevea brasiliensis（Willd. ex A. Juss.） Muell. Arg.，XP—021692374.1]、梅（Prunus mume，XP—008236378.1）、胡桃（Juglans regia L，XP—018 827699.1）、美洲棉（G. raimondii，KJB4736 1.1）和陸地棉（G. hirsutum L，ABZ01817.1）的CDA氨基酸序列相似性為75.26%～79.73%;FtCAD-2蛋白與GenBank中上述同源序列的氨基酸序列相似性為74.04%～79.89%。利用DNAMAN 9.0將FtCAD-1和FtCAD-2與其他物種的同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示FtCAD-1和FtCAD-2與其他植物的CAD蛋白均含有3個(gè)CAD蛋白家族的典型保守結(jié)構(gòu)域（圖7）。

運(yùn)用MEGA 6.0構(gòu)建擬南芥[Arabidopsis thaliana（L.） Heynh.]的9個(gè)AtCAD蛋白、其他7種植物的CAD蛋白及FtCAD-1和FtCAD-2的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖7所示。這些蛋白可分成3支，F(xiàn)tCAD-1和FtCAD-2蛋白分別聚在不同分支。其中，F(xiàn)tCAD-1與擬南芥AtCAD4和AtCAD5、葡萄（Vitis vinifera L.）VvCAD1、黃花蒿（Artemisia annua L.）AaCAD、橡膠樹(shù)HbCAD、煙草（Nicotiana tabacum L.）NtCAD1、銀合歡[Leucaena leucocephala（Lam.） de Wit]LlCAD聚為一支，屬于第一類(lèi)CAD蛋白。由于AtCAD4和AtCAD5蛋白在擬南芥木質(zhì)素的合成中發(fā)揮重要作用（Jourdes et al.，2007），由此推測(cè)FtCAD-1蛋白在苦蕎木質(zhì)素的合成中發(fā)揮重要作用。由于FtCAD-2與擬南芥的AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6、AtCAD7、AtCAD8、AtCAD9及陸地棉GhCAD9和番薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]IbCAD聚為一個(gè)分支，屬于第二類(lèi)CAD蛋白。AtCAD1蛋白單獨(dú)聚為一個(gè)分支，屬于第三類(lèi)CAD蛋白。

2. 3 基因組織表達(dá)特性分析結(jié)果

qRT-PCR檢測(cè)苦蕎FtCAD-1和FtCAD-2基因在厚果殼與薄果殼苦蕎不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖9所示。FtCAD-1和FtCAD-2基因在不同組織的表達(dá)水平存在明顯差異。FtCAD-1和FtCAD-2基因均在種仁中的相對(duì)表達(dá)量最高，且厚果殼與薄果殼苦蕎間無(wú)顯著差異（P>0.05）。FtCAD-1基因在厚果殼苦蕎葉、花和果殼中的相對(duì)表達(dá)量顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01，下同）高于薄果殼苦蕎，尤其是在厚果殼苦蕎果殼中相對(duì)表達(dá)量是薄果殼苦蕎的16倍，但在薄果殼苦蕎莖中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于厚果殼苦蕎。FtCAD-2基因除了在薄果殼苦蕎果殼中相對(duì)表達(dá)量顯著高于厚果殼苦蕎外，在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)為厚果殼苦蕎高于薄果殼苦蕎，尤其是在厚果殼苦蕎花和莖的相對(duì)表達(dá)量顯著高于薄果殼苦蕎。由此推測(cè)FtCAD-1基因?yàn)榭刂瓶嗍w厚薄果殼性狀的關(guān)鍵基因。

3 討論

苦蕎有“五谷之王”“三降食品”的美稱(chēng)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用功效極高。但目前市面上的栽培苦蕎大部分難以脫殼，嚴(yán)重影響了有效成分的利用。通過(guò)基因工程的方法探究厚果殼形成的調(diào)控機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。CAD作為植物木質(zhì)素合成過(guò)程中的重要限速酶，能將不同的肉桂醛轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的肉桂醇，進(jìn)而影響木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)及形成，是非常理想的調(diào)控木質(zhì)素合成的控制酶（Tobias and Chow，2004）。已有較多研究表明，CAD基因在木質(zhì)素合成途徑中發(fā)揮重要調(diào)控作用，且其表達(dá)量與木質(zhì)素含量成正相關(guān)（劉莉等，2013;胡丹等，2015;郭永翠等，2020）。本研究從厚果殼苦蕎品種云蕎1號(hào)和薄果殼苦蕎品種小米蕎均克隆獲得FtCAD-1和FtCAD-2基因，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二者在葉、花、莖、果殼和種仁中均有表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量存在明顯差異。FtCAD-1基因在厚果殼苦蕎果殼中的相對(duì)表達(dá)量是薄果殼苦蕎的16倍，二者的差異達(dá)極顯著水平，而FtCAD-2基因在薄果殼苦蕎的相對(duì)表達(dá)量顯著高于厚果殼苦蕎。通過(guò)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，厚果殼苦蕎的FtCAD-1和FtCAD-2基因序列與薄果殼苦蕎的FtCAD-1和FtCAD-2基因序列完全一致，而基因表達(dá)受到多種因素的影響，如啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子的激活、光照、時(shí)間、溫度等，推測(cè)FtCAD-1基因可調(diào)控苦蕎果殼的木質(zhì)素合成進(jìn)而影響果殼厚度。

前人研究發(fā)現(xiàn)，CAD以多基因家族的形式存在，不同植物的CAD基因數(shù)目不同，功能也不同。例如模式植物擬南芥中主要存在9個(gè)CAD基因，其中AtCAD4和AtCAD5屬于第一類(lèi)CAD基因，均參與維管束的發(fā)育過(guò)程，在木質(zhì)素的生物合成過(guò)程中將松柏醛和芥子醛還原為相應(yīng)的醇;AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6、AtCAD7、AtCAD8和AtCAD9屬于第二類(lèi)CAD基因，AtCAD1屬于第三類(lèi)CAD基因（Kim et al.，2004）。本研究的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，F(xiàn)tCAD-1與擬南芥的AtCAD4和AtCAD5聚在一支，故推測(cè)FtCAD-1基因?qū)儆诘谝活?lèi)CAD基因，參與調(diào)控木質(zhì)素生物合成;FtCAD-2與擬南芥的AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6、AtCAD7、AtCAD8、AtCAD9等聚在一支，故推測(cè)FtCAD-2屬于第二類(lèi)CAD基因。相對(duì)第一類(lèi)CAD基因而言，第二和三類(lèi)CAD基因在木質(zhì)素生物合成中的作用并不突出，是第一類(lèi)CAD基因的冗余基因（Kim et al.，2004）。因此，推測(cè)FtCAD-2基因在木質(zhì)素合成方面作用不是很突出。多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)FtCAD-1和FtCAD-2雖然均含有3個(gè)CAD蛋白的典型保守結(jié)構(gòu)域，但序列不完全一致。且FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)也明顯不同，其中FtCAD-1與2cf5.1.B的結(jié)構(gòu)相似度較高，而FtCAD-2與5z0c.1.A的結(jié)構(gòu)相似度更高。由于蛋白結(jié)構(gòu)決定其功能，證明二者功能存在明顯差異。因此本研究獲得的苦蕎FtCAD-1和FtCAD-2基因在薄果殼苦蕎木質(zhì)素生物合成途徑的調(diào)控功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

FtCAD-1基因?qū)儆诘谝活?lèi)CAD基因，具有明顯的組織表達(dá)特異性，推測(cè)其在苦蕎木質(zhì)素生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）