常逢彤，馮謙潔，黎 娜，周海龍

（海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實驗室/生命科學(xué)與藥學(xué)院 ?？?570228）

海巴戟（Morinda citrifoliaLinn）為茜草科（Rubiaceae）巴戟天屬（Morinda）植物，國外稱之為諾麗（Noni）[1]，廣泛種植于太平洋地區(qū)，作為保健及藥用植物已有上千年的歷史[2]，其果實、葉子、枝干、根部均可入藥[3]，在我國海南島、西沙群島和臺灣島也有分布。海巴戟各部位提取物均具有一定的抗菌、抑瘤等作用[4?5]，其果實提取物是安全的天然抗氧化劑，具有抗氧化活性[6]、保護(hù)心肌細(xì)胞[7]和抑制腫瘤生長的作用，葉子提取物可用于治療潰瘍和輕微感染[8]。海巴戟的根、葉、果均含有抗氧化活性成分，且根的抗氧化活性最強(qiáng)[9]。海巴戟果汁對四氯化碳（CCl4）引起的肝損傷小鼠具有肝保護(hù)功能[10]。有研究表明，關(guān)節(jié)病患者攝入海巴戟果汁可以控制炎癥，緩解關(guān)節(jié)不適，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[11]。由于海巴戟富含多種活性成分，國際市場已將它定位為藥品和保健食品[12]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種革蘭氏陰性菌，屬于弧菌科（Vibrionaceae）、弧菌屬（Vibrio），無芽胞，有鞭毛，形態(tài)呈桿狀、弧狀、卵圓狀等。該菌在含2%～4%氯化鈉的培養(yǎng)基中生長旺盛，在氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于2%時基本不生長。副溶血性弧菌的致病性是溶血素、脲酶、黏附因子和分泌系統(tǒng)等多種致病因子相互作用的結(jié)果，機(jī)理較復(fù)雜。其主要致病因子是多種溶血毒素，主要有不耐熱溶血毒素(Thermolabile hemolysin，TLH)，耐熱直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin，TDH)和相對耐熱直接溶血毒素(TDH-related hemolysin，TRH)[13]。副溶血性弧菌常存在于海洋和河口生態(tài)系統(tǒng)及魚、蝦、貝類等水產(chǎn)品中[14]。凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)又稱南美白對蝦，由于凡納濱對蝦具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力、生長快和抗病力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益顯著等特點(diǎn)，是目前世界上養(yǎng)殖單產(chǎn)最高的對蝦品種[15]，也是世界三大高產(chǎn)量對蝦養(yǎng)殖品種之一[16]。隨著對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對蝦養(yǎng)殖病害發(fā)生頻率亦相應(yīng)增加，由副溶血性弧菌引起的疾病最常見，如紅體病、紅腿病、白斑病、腸炎病、爛鰓病等，導(dǎo)致對蝦養(yǎng)殖業(yè)蒙受了巨大損失。近年來，急性肝胰腺壞死病（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND）在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中廣為流行，患病對蝦表現(xiàn)為紅體、殼軟，腸胃排空，肝胰腺變色、腫大后呈纖維化萎縮，最終壞死。該病3～5 d 致死率高達(dá)90%[17]。我國于2010 年在海南省首次發(fā)現(xiàn)該疾病，隨后全國大部分對蝦養(yǎng)殖區(qū)遭受感染，損失慘重。2012 年，LIGHTNER 等[18]首先報了AHPND 的致病原是副溶血弧菌，隨后，又有多篇報道證明AHPND 是由副溶血弧菌引起[19?23]，通過控制副溶血性弧菌可以大大減少AHPND 暴發(fā)的風(fēng)險[24]。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對副溶血性弧菌的防治主要依賴抗生素，但抗生素的長期使用使得耐藥菌株不斷出現(xiàn)，多種副溶血性弧菌菌株已產(chǎn)生光譜耐藥性。相關(guān)研究表明，副溶血性弧菌已對磺胺類、頭孢類、氨基糖苷類和青霉素類藥物出現(xiàn)不同程度的耐藥性，對阿莫西林的平均耐藥率已高達(dá)50%[25?27]。因此，尋找一種有效的天然抗菌物質(zhì)已成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。據(jù)報道，植物提取物中的生物堿、萜類、單寧、皂苷、糖苷、黃酮類、酚類、甾體和精油等具有促進(jìn)生長、改善免疫系統(tǒng)、抗菌能力、刺激食欲和抗應(yīng)激特性等特性[28?30]。使用植物提取物作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素可持續(xù)有效的替代品，具有治療成本低、生物降解性好、耐藥性低等優(yōu)點(diǎn)[31?34]。本研究針對副溶血性弧菌對對蝦產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重危害性，以海巴戟為材料，探究其提取物對凡納濱對蝦副溶血性弧菌的抑制效果，旨在為海巴戟在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料海巴戟果購于?？谀侈r(nóng)貿(mào)市場；副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）為中國科學(xué)院海洋研究所分離株。

1.2 海巴戟熱水提取物的制備采用傳統(tǒng)煎煮法[35]對海巴戟果有效成分進(jìn)行提取。取30 g 曬干的成熟海巴戟果，粉碎機(jī)粉碎后，加300 mL 水，浸泡30 min 后加熱煮沸5 min（先文火后武火，期間邊煮邊攪拌），4 層紗布過濾，濾渣再加100 mL 水，直接加熱煮沸5 min，4 層紗布過濾，合并2 次所得濾液。將合并后的濾液濃縮至30 mL，此時海巴戟果熱水提取液終質(zhì)量濃度為1 g·mL?1。將得到的提取物經(jīng)高壓滅菌（121 ℃，15 min）后分裝于EP 管中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 副溶血性弧菌菌液的制備用滅菌接種環(huán)將副溶血性弧菌劃線接種與TCBS 瓊脂平板上，于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h；挑取單個菌落接種于5 mL TCBS 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，180 r·min?1搖床培養(yǎng)12 h 后，用無菌生理鹽水稀釋，至菌液終密度為1.0×107cfu·mL?1，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 濾紙片法測定紫外線對海巴戟果提取物抑菌能力的影響取海巴戟果提取物原液15 mL 至于滅菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行紫外燈照射，照射時長分別為0、5、10、15、20、25 min，將副溶血性弧菌作為指示菌，取10 μL海巴戟果提取物原液吸附與滅菌濾紙片上，用無菌鑷子置于含菌平板表面。平板置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12～16 h，觀察并采用十字測量法記錄抑菌圈直徑。每個試驗組設(shè)置3 個重復(fù)，每個平板放置3 片濾紙，抑菌圈直徑取平均值。

1.5 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定采用中藥抗菌實驗試管二倍稀釋法[36]測定海巴戟果提取物的MIC 和MBC。取13 支無菌試管依次編號，1 號試管加9 mL TCBS 液體培養(yǎng)基，其余12 支試管，每管加5 mL。移液槍吸取濃度為1 g·mL?1的海巴戟果提取物2 mL，加入1 號試管中混勻；從1 號試管中取5 mL 加入2 號試管搖勻，如此依次倍比稀釋直至11 號試管，最后從11 號試管中吸取5 mL 棄去。至此，1～12 號試管中海巴戟果提取物的質(zhì)量濃度分別為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0 g·L?1，12 號試管為對照。在1～12 號試管中分別加入密度為1.0×107cfu·mL?1的菌液0.2 mL 并混勻，13 號試管不加菌液，為空白對照。將13 支試管放入30 ℃，180 r·min?1搖床培養(yǎng)12～16 h，根據(jù)試管內(nèi)液體的混濁程度判定海巴戟果提取物的MIC 值（無菌液生長，液體澄清）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，試管內(nèi)依舊澄清的最小濃度為其MBC 值。

分別取上述培養(yǎng)12～16 h 和培養(yǎng)48 h 的試管內(nèi)液體，采用涂布平板的方法[37]對海巴戟果提取物的MIC 和MBC 值進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

1.6 煮沸時長對海巴戟果提取物抑菌作用的影響取海巴戟果，分別煮沸0、5、10、15、20、25 min，4 層紗布過濾，將得到的濾液經(jīng)高壓滅菌（121 ℃，15 min）后分別裝與EP 管中，4 ℃保存，備用。

取7 支試管，對照組編號為0，其余6 支依次編號為1～6，0～6 號試管中分別加入10 mL TCBS 培養(yǎng)基，1～6 號試管分別加煮沸0、5、10、15、20、25 min 的海巴戟果提取物3 mL，7 支試管分別接種5 μL 副溶血性弧菌，搖床培養(yǎng)（30 ℃，180 r·min?1）12～16 h。另準(zhǔn)備7 支試管，分別取0～6 號試管中的菌液1 mL，加9 mL PBS 緩沖液，得到稀釋液A0～A6，接著分別取A0～A6 試管中的菌液1 mL，加9 mL PBS 緩沖液，得到稀釋液B0～B6。

制板，分別取B0～B6 試管中的菌液5 μL，在培養(yǎng)皿上涂布均勻，每支試管設(shè)置3 個重復(fù)，30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，觀察菌落生長情況，對各個培養(yǎng)皿分別計數(shù)并通過以下公式計算抑菌率（%）。

抑菌率=（對照皿菌落數(shù)?試驗皿菌落數(shù)）/對照皿菌落數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線對海巴戟果提取物抑菌能力的影響通過控制紫外燈照射時長，對分別照射0、5、10、15、20、25 min 的海巴戟果提取物進(jìn)行涂布平板抑菌試驗，對應(yīng)的抑菌圈平均直徑分別為11.2、8.4、8.0、6.7、0、0 mm。

根據(jù)平均值繪制折線圖（圖1）。從圖1 可知，紫外線會影響海巴戟果提取物的抑菌能力，紫外照射時間越長，抑菌能力越弱；當(dāng)紫外線作用時間≥20 min 時，培養(yǎng)皿中濾紙片周圍無抑菌圈產(chǎn)生。

實驗結(jié)果表明，紫外線照射會影響海巴戟果提取物的抑菌效果，紫外照射時間越長，抑菌能力越弱甚至消失。推測紫外線照射可能會分解海巴戟果提取物中的活性物質(zhì)，從而對其抑菌能力造成影響。

2.2 煮沸時長對海巴戟果提取物抑菌作用的影響從圖2 可知，浸泡30 min（0 組）和對照組之間差異不顯著，煮沸5 min 和浸泡30 min 相比差異顯著，但是和煮沸10 min 差異不顯著。分別煮沸15、20、25 min和煮沸5、10 min 相比差異極顯著，但是三者之間差異不顯著。煮沸0、5、10、15、20、25 min 的海巴戟果提取物對副溶血性弧菌的抑菌率分別為12.64%、45.76%、48.64%、71.68%、71.36%、70.88%（表1）。煮沸能夠顯著提高海巴戟果提取物對副溶血性弧菌的抑制作用。根據(jù)實驗結(jié)果，分別煮沸0、5、10、15 min 時，海巴戟果提取物的抑菌率依次增大，15 min 后，煮沸時長對其抑菌作用的幾乎沒有影響。煮沸15 min 的海巴戟果提取物抑菌效率最大。

圖1 紫外線照射時長處理的海巴戟果提取液對副溶血性弧菌抑菌效果的影響Fig.1 Effect of the hot-water noni fruit extract under different ultraviolet exposure durations on bacteriostasis of V.parahaemolyticus

圖2 不同煮沸時長海巴戟果提取物對副溶血性弧菌菌落數(shù)的影響數(shù)據(jù)柱（點(diǎn)）標(biāo)注相同字母表示差異不顯著（P > 0.01），不同字母表示差異顯著（P < 0.01）。Fig.2 Inhibition of number of colonies of V.parahaemolyticus by the hot-water noni fruit extract at different boiling durations Value columns (points) with the same letters mean significant difference at P > 0.01, while those with different letters mean significant difference at P < 0.01.

2.3 海巴戟果提取物MIC 值和MBC 值添加不同質(zhì)量濃度的海巴戟果提取物，培養(yǎng)12 h 后，1～13 支試管中，4～12 號試管內(nèi)液體混濁，1～3 號試管內(nèi)液體澄清，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，3 號試管出現(xiàn)輕微混濁，1～2 號試管內(nèi)液體依舊澄清，該結(jié)果初步表明，副溶血性弧菌的生長在海巴戟果提取物的質(zhì)量濃度達(dá)到25.00 g·L?1時明顯受到抑制，當(dāng)海巴戟果提取物的質(zhì)量濃度達(dá)到50 g·L?1時，副溶血性弧菌不生長。準(zhǔn)備副溶血性弧菌培養(yǎng)皿，分別對培養(yǎng)12 h 和48 h 的試管內(nèi)菌液進(jìn)行涂布培養(yǎng)，如表2、表3 所示，培養(yǎng)12 h后，海巴戟果提取物的質(zhì)量濃度≥25.00 g·L?1時，培養(yǎng)皿中沒有副溶血性弧菌，據(jù)此判斷，海巴戟果提取物的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）值為25.00 g·L?1。繼續(xù)培養(yǎng)36 h 后，海巴戟果提取物質(zhì)量濃度為25.00 g·L?1的培養(yǎng)皿中出現(xiàn)副溶血性弧菌，而海巴戟果提取物質(zhì)量濃度為50.00 g·L?1和100 g·L?1的培養(yǎng)皿中仍沒有副溶血性弧菌生長，據(jù)此得出其MBC 值為50.00 g·L?1。

表1 不同煮沸時間對海巴戟果提取物抑菌率的影響Tab.1 Effect of hot-water noni fruit extract on bacteriostatic rate at different boiling time

表2 添加不同質(zhì)量濃度海巴戟果提取物培養(yǎng)12 h 后副溶血性弧菌生長情況Tab.2 The growth of V.parahaemolyticus after 12 h culture with different concentrations of the hot-water noni fruit extract

表3 添加不同質(zhì)量濃度海巴戟果提取物培養(yǎng)48 h 后副溶血性弧菌生長情況Tab.3 The growth of V.parahaemolyticus after 48 h culture with different concentrations of the hot-water noni fruit extract

3 討 論

紫外線照射會影響海巴戟果提取物的抑菌能力，當(dāng)紫外線照射時間≥15 min 時，其提取物失去抑菌作用。凡納濱對蝦的人工養(yǎng)殖大都采用露天養(yǎng)殖場，向養(yǎng)殖池中添加海巴戟果提取物時，應(yīng)避開紫外線較強(qiáng)的時候，因此，最好早晚補(bǔ)給，尤其是在紫外線較強(qiáng)的海南省，以免影響其抑菌作用的發(fā)揮。中藥材多為植物或動物的干燥組織，或者是礦物類，動、植物其細(xì)胞干枯萎縮，藥物有效成份結(jié)晶或定形沉淀存在于細(xì)胞內(nèi)，組織外表也變的緊密，使水分不易滲入和溶出。海巴戟果質(zhì)地較重，其細(xì)胞干枯萎縮，藥物有效成分結(jié)晶或定形沉淀存在于細(xì)胞內(nèi)，組織外表也變得緊密，簡單的浸泡無法獲得其有效成分，煮沸時間也要≥15 min，才能使其更好地發(fā)揮藥效。海巴戟果提取物抑制副溶血性弧菌的MIC 為25 g·L?1，MBC 為50 g·L?1。

據(jù)研究，采用有機(jī)溶劑無水乙醇獲得的花椒籽和大蒜提取物對副溶血性弧菌也具有抑制作用，MIC 分別為12.50 g·L?1和18.25 g·L?1[38?39]。與之相比，海巴戟果熱水提取液對副溶血性弧菌的MIC 為25.00 g·L?1，高于花椒籽和大蒜提取物。但從制備方法上考慮，本研究采用的熱水煮沸方法簡單易行，與有機(jī)溶劑相比，成本較低，能夠降低凡納濱對蝦養(yǎng)殖中對副溶血性弧菌的防治成本，提高養(yǎng)殖利潤。

溫度升高均不利于花椒籽提取物和大蒜提取物抑菌效果的發(fā)揮，花椒籽提取物適宜溫度范圍為20～40 ℃；大蒜提取物在溫度高于50 ℃時易被氧化[38?39]。相比之下，海巴戟果熱水提取液因其制備條件，避免了高溫對其抑菌效果的影響。紫外線照射也會使花椒籽和大蒜提取物抑菌能力減弱[38?39]，這一結(jié)果與本研究相同。

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，養(yǎng)殖水域環(huán)境趨于惡化，各類細(xì)菌病和病毒病頻繁發(fā)生，給養(yǎng)殖者帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在大力倡導(dǎo)健康養(yǎng)殖、保證畜禽產(chǎn)品安全、保障人類健康的今天，海巴戟果提取液被證明對副溶血性弧菌有抑制作用，該結(jié)果為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域防治副溶血性弧菌病提供了依據(jù)。