吳重陽，敖科萍，王遠芳，吳思穎，王旻晉，肖玉玲，李冬冬，謝 軼，應斌武

四川大學華西醫(yī)院實驗醫(yī)學科，四川成都 610041

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全球范圍內(nèi)迅速蔓延[1-3]。臨床診斷基于流行病學史、實驗室指標檢測和肺部CT檢查，COVID-19確診主要依賴于病毒核酸的測定。然而核酸檢測操作復雜、費時長及存在假陰性等問題，可導致診斷延遲，因此需要其他方法彌補核酸檢測的不足[4]?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》[5]中明確指出新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)特異性抗體陽性為COVID-19的確診標準之一，目前已有針對SARS-CoV-2的免疫球蛋白(Ig)M和IgG抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和膠體金檢測試劑盒[6]，可對臨床疑似患者進行篩查，以完善實驗室檢查項目。本研究以膠體金法與ELISA檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體的臨床診斷價值為研究點進行比較分析，了解2種試劑盒在檢測不同病程COVID-19患者血清病毒抗體的靈敏度和特異度，并評價方法學的一致性和可靠性。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者診斷參照國家衛(wèi)生健康委員會制訂的《關于新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[7]執(zhí)行，根據(jù)2次以上核酸檢測結果將2020年1-2月在本院住院的患者分為確診患者組38例，有典型的臨床癥狀和肺部影像學特征，2次以上核酸結果陽性；疑似患者組43例，連續(xù)2次(間隔24 h以上)核酸檢測結果陰性，合并其他呼吸道細菌或病毒感染。本研究已通過四川大學華西醫(yī)院倫理審查，倫理批準文號2020年審(429)號。

1.2儀器與試劑 SARS-CoV-2特異性抗體IgM和IgG的ELISA檢測試劑盒和膠體金法檢測試劑盒均購自珠海麗珠試劑股份有限公司。IgM抗體檢測根據(jù)捕獲法原理，以抗人IgM-μ鏈(包被二抗)包被微孔板，IgG抗體檢測根據(jù)間接法原理，以重組SARS-CoV-2抗原(包被抗原)包被微孔板，嚴格按照生物安全要求和試劑盒說明書進行操作和結果判斷。

1.3病毒抗體動態(tài)變化 選擇13例患者的不同感染時間點的血清標本，研究時間是從患者入院后第一次采集的血清標本開始，病程計算是從患者有發(fā)熱、咳嗽等臨床癥狀到檢測血清抗體的時間，以核酸檢測結果為參照，觀察病毒抗體動態(tài)變化。核酸檢測所用引物、試劑和方法參考文獻[8]。

1.4統(tǒng)計學處理 應用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。靈敏度、特異度等指標的比較使用配對資料χ2檢驗，采用Kappa值評價2種檢測方法的一致性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1臨床特異度評價 43例疑似患者中，膠體金法試劑盒檢測IgM、IgG抗體均有40例陰性，3例假陽性，臨床特異度為93.02%(40/43)；ELISA試劑盒檢測IgM、IgG抗體均有42例陰性，1例假陽性，臨床特異度為97.67%(42/43)；其中1例患者有發(fā)熱、咳嗽、咳痰等臨床癥狀，呼吸道13種病毒篩查結果顯示SARS-CoV-2核酸檢測結果陽性，膠體金法和ELISA同時檢測2種特異性抗體均為陽性；2例膠體金法檢測結果為弱陽性的患者無任何COVID-19臨床表現(xiàn)，僅表現(xiàn)為普通病毒感冒癥狀，核酸檢測結果均為陰性。結果表明這2種抗體檢測試劑盒有較高的臨床特異度，能夠滿足COVID-19的篩查和診斷要求。

2.2臨床靈敏度評價 38例確診患者中，膠體金法試劑盒檢測IgM、IgG抗體的靈敏度分別為63.16%(24/38)、76.32%(29/38)；IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(IgM和IgG抗體任一陽性即確定為陽性)陽性30例，聯(lián)合檢測的靈敏度為78.95%(30/38)；ELISA試劑盒檢測IgM、IgG抗體靈敏度分別為55.26%(21/38)、60.53%(23/38)；IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測陽性27例，聯(lián)合檢測的靈敏度為71.05%(27/38)。結果表明，SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測在COVID-19患者中具有較高的檢出率，是核酸檢測漏檢的良好補充。

2.32種方法檢測確診患者不同病程血清IgM和IgG抗體結果比較 13例不同感染時間點的確診患者，其中男7例，女6例，年齡19～81歲。13例確診患者病程<3 d時IgM抗體均為陰性，當病程≥7 d時，膠體金法檢測IgM、IgG抗體的陽性率均高于ELISA。見表1。

表1 2種方法檢測確診患者不同病程血清IgM和IgG抗體結果比較[n(%)]

2.4膠體金法和ELISA檢測結果比較 81例研究對象的ELISA和膠體金法檢測特異性抗體IgM和IgG結果比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.745、0.805，均P>0.05)。疑似患者組中有1例患者血清的特異性抗體IgG為弱陽性，IgM為陰性，且呼吸道13種病毒檢測中的SARS-CoV-2核酸陽性，結合影像學和血細胞分析結果，考慮不支持COVID-19，為假陽性。

3 討 論

目前，SARS-CoV-2核酸檢測結果陽性雖是疑似患者確診的“金標準”，但其操作繁瑣、耗時長，檢測結果易受標本質量、病毒感染部位及表達量等眾多因素影響，因而核酸單項檢測不能滿足疫情期間對疑似患者快速篩查的要求[9]。一些符合臨床表現(xiàn)和肺部CT檢出結果的COVID-19疑似患者，其不同標本類型(咽拭子、肺泡灌洗液、糞便等)多次核酸檢測結果陰性，因此這些患者進行抗體檢測或可提高診斷效率[10-11]。流行病學數(shù)據(jù)表明，包括病毒特異性抗體(IgM和IgG)在內(nèi)的血清學應答可以進行血清學診斷。通常IgM抗體在感染早期出現(xiàn)，在SARS-CoV-2感染中最早可在第3天就檢測到，所以其結果可以作為早期診斷指標[12-13]。核酸檢測是確診SARS-CoV-2感染的最重要方法，但是該方法檢測時間長，操作步驟復雜且靈敏度不高，因此，SARS-CoV-2抗體檢測方法逐漸被開發(fā)。目前已有研究開始探索SARS-CoV-2 IgM、IgG和總抗體檢測的應用價值，LI等[14]對新研發(fā)的免疫層析法IgM和IgG抗體快速檢測試劑盒的檢測效果進行了評價，結果顯示其靈敏度和特異度分別為88.66%和90.63%。本研究中采用的ELISA和膠體金法檢測COVID-19確診患者IgM、IgG抗體特異度較高，進一步確認了SARS-CoV-2抗體檢測可為核酸檢測結果陰性患者的確診提供輔助診斷。

本研究中1例患者經(jīng)過多次核酸檢測得以確診，其在住院過程中多次采集咽拭子、糞便及肺泡灌洗液進行核酸檢測結果均為陰性，筆者在對該患者血清抗體連續(xù)監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)，膠體金法和ELISA檢測結果顯示IgM和IgG抗體陽性，且病程≥5 d后在血清中檢測到IgM/IgG抗體。在該患者發(fā)病7 d之后，ELISA檢測IgG抗體滴度開始增加。還有1例患者為家族聚集性病例，該患者顯示家族中4名成員均有COVID-19的典型臨床癥狀和明確的流行病學史，該患者的兒子、丈夫、兒媳因核酸檢測結果陽性確診，但該患者核酸檢測結果持續(xù)陰性而血清特異性抗體IgM/IgG結果均為陽性，同時該患者年齡大、基礎疾病多(合并慢性阻塞性肺疾病、高血壓等)，入院后多次采集肺泡灌洗液標本困難，只能采集鼻咽拭子或糞便標本，核酸檢測結果均為陰性。筆者采用膠體金法對該患者進行連續(xù)性血清特異性抗體檢測，顯示在入院3 d后IgM抗體轉為陽性，10 d后IgG抗體轉為陽性。血清特異性抗體檢測窗口期與SARS-CoV-2核酸檢測類似，而膠體金法對標本質量的要求不如核酸檢測嚴格，當在呼吸道標本中檢測不到病毒核酸時，但可以檢測到特異性抗體的存在。因此以上2例患者得以通過臨床癥狀和早期抗體檢測結果確診，可避免核酸檢測中因采樣要求高、檢測時間長和操作步驟繁瑣等問題導致的假陰性結果出現(xiàn)，同時表明血清抗體的檢測可以在一定程度上彌補核酸檢測漏檢的風險[15]。雖然病毒核酸可在COVID-19患者1～5 d上呼吸道咽拭子中檢出，但受病毒感染機制及采樣部位影響，仍然存在上呼吸道咽拭子核酸檢測結果陰性，臨床癥狀及流行病史和實驗室其他檢查數(shù)據(jù)又高度懷疑COVID-19的情況。因此，抗體聯(lián)合核酸檢測可有助于進一步提高SARS-CoV-2感染的檢出率，有助于彌補核酸檢測的不足。

本研究中，2種方法檢測IgM抗體的靈敏度均不高，可能有以下原因：(1)確診患者數(shù)量有限，對檢測方法的應用評價還不全面，無法更準確地反映試劑盒的診斷效能；(2)觀察時間點不統(tǒng)一，需要對患者進行連續(xù)長時間追蹤觀察。通過分析13例住院患者病程及所有COVID-19確診患者血清抗體檢測結果發(fā)現(xiàn)IgG抗體的陽性率要高于IgM抗體，這一研究結果與徐萬洲等[16]報道的數(shù)據(jù)一致?？赡芘c患者所處的感染時期及IgM抗體是稀釋后檢測有關，同時受到標本數(shù)量和試劑制備的影響。2種方法檢測抗體的特異度均≥90%，可能是由于COVID-19為新發(fā)疾病，目前人群普遍易感，血清中特異性抗體水平總體較低。同時，確診患者中存在核酸檢測結果陽性而抗體檢測結果陰性的情況，這可能與患者產(chǎn)生抗體的生理過程有關。由于抗體的產(chǎn)生都有窗口期，當患者血清中的抗體還未產(chǎn)生或水平低于檢測下限，那么此時免疫學方法就無法對其進行有效檢測。此外，在本研究中疑似患者組膠體金的弱陽性例數(shù)較多，其中1例患者呼吸道SARS-CoV-2核酸結果陽性，而膠體金法檢測IgM抗體結果陰性，IgG抗體結果弱陽性。冠狀病毒的核衣殼(N)蛋白相對保守，來自冠狀病毒Ⅰ型抗原的多克隆抗體，包括人冠狀病毒229E、貓傳染性腹膜炎病毒和豬傳染性胃腸炎病毒都與SARS-CoV感染的Vero細胞有關。表明SARS-CoV的N蛋白與抗原性Ⅰ類動物冠狀病毒的抗血清發(fā)生抗原性交叉反應[17]。因此，本研究所使用完整的N蛋白作為包被抗原進行血清學檢測可能會影響靈敏度和特異度，這也可能是在本研究中所使用的膠體金試劑盒檢測IgG抗體的靈敏度高于IgM抗體的原因。因此若抗體檢測陽性時應該動態(tài)檢測抗體滴度，結合臨床和核酸檢測結果進行鑒別診斷，以排除其他冠狀病毒感染的可能性。類風濕因子、嗜異性抗體、補體及外源性干擾等因素也可能造成試驗結果的假陽性。研究表明當患者體內(nèi)存在高類風濕因子抗體時，假陽性率可高達60%[18]。

綜上所述，2種方法對確診和疑似患者的診斷無明顯差異，在應用價值上各有優(yōu)缺點。膠體金檢測試劑盒不需要復雜設備，具有操作簡單、快速等優(yōu)點，適用于醫(yī)院急診、門診、重癥監(jiān)護室、傳染科等臨床科室快速篩查[19]。對疑似患者血清標本進行特異性抗體檢查，增加了COVID-19檢測手段，有早期預報、回顧性診斷和流行病學研究的意義，對深入認識疫情的發(fā)生發(fā)展具有重要價值[20]。