孟 海，趙成禮，潘偉偉,盧 芩

1.江蘇省鹽城市濱海縣人民醫(yī)院消化科，江蘇鹽城224500；2.東南大學附屬中大醫(yī)院消化科，江蘇南京 210009

WEE1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因家族的成員。在哺乳動物中，WEE1編碼一個相對分子質量為94×103的蛋白，含647個氨基酸殘基，并與髓鞘轉錄因子組成一個小的基因家族[1-2]。有研究表明，WEE1在各種類型的人類惡性腫瘤中的表達增加，包括黑色素瘤、卵巢癌、肝細胞癌、膠質母細胞瘤和乳腺癌，抑制WEE1的表達可抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡[3-4]。此外，WEE1蛋白的選擇性抑制劑AZD1775通過促進DNA修復而增強T淋巴細胞急性淋巴細胞白血病對阿糖胞苷的敏感性[5]。因此，本研究選取74例胃癌患者、32例癌前病變患者、34例胃部良性疾病患者為研究對象，探討WEE1在胃部不同病變組織中的差異性表達及臨床意義，以期為胃癌的機制研究提供更多依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年1月至2013年9月濱?？h人民醫(yī)院收治的胃癌患者為研究對象。納入標準：(1)首次確診胃癌。(2)術前未行放化療等抗腫瘤治療。(3)無胃部手術史及其他病史。(4)臨床資料及隨訪資料完整。排除標準：(1)圍術期死亡病例。(2)合并有其他器官或系統(tǒng)的惡性腫瘤或有惡性腫瘤史。(3)因腫瘤相關腸梗阻等行急診手術。最終，74例患者被納入研究。其中男44例，女30例；年齡32～83歲，中位年齡54歲。選取同期因胃部癌前病變或胃部良性疾病而行切除手術的患者66例，其中腸型化生患者20例、異型增生患者8例、慢性萎縮性胃炎患者4例、胃部良性疾病患者34例，收集其標本及預后數據(無瘤生存期和5年生存率)。

1.2方法 采用免疫組化法檢測胃部病變組織及正常組織中WEE1的表達。將2 μm厚度的組織切片在60 ℃下切烤1 h，二甲苯中脫蠟，乙醇洗滌(100%乙醇3 min，2次；95%乙醇3 min，2次；蒸餾水3 min)；隨后，切片在枸櫞酸緩沖液(0.01 mmol/L，pH值為6.0，購自北京中山金橋生物技術有限公司)中進行微波熱誘導抗原3 min，并冷卻至室溫，再逐漸加蒸餾水沖洗至少20 min；蒸餾水沖洗后，采用3%過氧化氫在室溫下阻斷內源性過氧化物酶；切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5次(每次2 min)；在4 ℃下與多克隆兔抗人WEE1抗體過夜孵育(稀釋度1∶75)；再次用PBS沖洗5次(每次2 min)后，切片用抗兔過氧化物免疫球蛋白G(稀釋度1∶300)在37 ℃下孵育30 min；蘇木精染色。通過計數區(qū)域的200個細胞檢測WEE1染色，這些細胞集中在腫瘤細胞上。根據以往研究評分[6]：0為無陽性細胞；1+為<10%陽性細胞；2+為10%～50%陽性細胞；3+為>50%陽性細胞。如果評分為0，則WEE1蛋白的表達被定義為WEE1陰性；如果評分為1+、2+或3+，則被歸類為WEE1陽性。

2 結 果

2.1WEE1在不同胃部病變組織中的表達 WEE1在胃癌細胞的細胞質、細胞核內均有表達，總體陽性率為43.2%(32/74)。在正常胃組織中陽性率為8.8%(3/34)。在癌前病變組織中的總體陽性率為21.9%(7/32)，其中腸型化生、異型增生、慢性萎縮性胃炎的陽性率分別為25.0%(5/20)、12.5%(1/8)、25.0%(1/4)。WEE1在胃癌組織中的陽性率高于正常胃組織及癌前病變組織(χ2=12.600、5.895，均P<0.05)。見表1、圖1。

表1 WEE1在不同胃部病變組織中的表達(n)

2.2WEE1表達與胃癌病理參數的關系 腫瘤最大徑、T分期、N分期、脈管浸潤對WEE1表達有影響(P<0.05)，但腫瘤部位、WHO分型、Lauren分型、M分期對WEE1表達無明顯影響(P>0.05)。見表2。

2.3WEE1表達對患者預后的影響 對74例胃癌患者進行隨訪，6例患者失訪，均為WEE1陰性患者；5年內胃癌患者死亡41例，其中，WEE1陰性組13例、WEE1陽性組28例，2組患者的5年生存率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=32.690，P<0.05)。見表3。

注：A為WEE1在正常胃組織中的陰性表達；B為WEE1在正常胃組織中的陽性表達；C為WEE1在腸型化生胃組織中的陰性表達；D為WEE1在腸型化生胃組織中的陽性表達；E為WEE1在胃癌組織中的陰性表達；F為WEE1在胃癌組織中的陽性表達。

表2 WEE1表達與胃癌病理參數的關系(n)

續(xù)表2 WEE1表達與胃癌病理參數的關系(n)

表3 WEE1表達對患者預后的影響

3 討 論

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著我國社會經濟的發(fā)展，人們的生活習慣、飲食習慣發(fā)生巨大改變，胃癌的發(fā)病率明顯升高，尋找治療胃癌的分子靶點有重要意義[7-8]。WEE1激酶是一種在細胞有絲分裂前G2～M期檢查點阻滯中發(fā)揮關鍵作用的酶類[9-10]。正常細胞在G1期修復DNA，但腫瘤細胞伴有G1～S期檢查點缺陷，通常依賴G2～M期檢查點完成DNA修復，這為靶向WEE1激酶抑制的應用提供了理論基礎[11-12]。臨床研究證實，WEE1抑制劑AZD1775對一線治療抵抗或耐藥的TP53突變卵巢癌患者有效[13]，但在胃癌中，WEE1的相關研究尚處于起步階段。

本研究選取了74例胃癌患者、32例癌前病變患者、34例胃部良性疾病患者為研究對象，采用免疫組化法檢測胃部病變組織及正常組織中WEE1的表達，結果發(fā)現(xiàn)，WEE1在胃癌、癌前病變、正常胃組織的陽性率分別為43.2%(32/74)、21.9%(7/32)、8.8%(3/34)，胃癌組織中的陽性率高于正常胃組織及癌前病變組織(P<0.05)。與其他研究不同，本研究遵循胃癌的自然發(fā)生模式，即“正常組織-癌前病變-胃癌”模式進行WEE1檢測，結果發(fā)現(xiàn)檢出率呈明顯升高趨勢。這表明，隨著WEE1表達強度的升高，機體對正常胃黏膜轉變?yōu)閻盒约毎囊种颇芰p弱，細胞發(fā)生惡性增殖的能力變強，促進了胃癌的發(fā)生。本研究進一步分析了WEE1表達與胃癌臨床病理參數的關系，結果發(fā)現(xiàn)，腫瘤最大徑、T分期、N分期、脈管浸潤對WEE1表達有影響。這提示臨床，WEE1的表達上調可能參與了胃癌細胞的浸潤和淋巴結轉移的調節(jié)。這可能是由于：(1)WEE1陽性意味著胃癌細胞有更強大的分化增殖能力，致使腫瘤細胞更易生長、侵入淋巴管或血管，造成淋巴結轉移甚至遠隔轉移。(2)脈管癌栓與胃癌分期有密切關系，WEE1可能通過促進脈管癌栓從而促進腫瘤轉移。本研究隨訪發(fā)現(xiàn)，WEE1陽性患者死亡28例，WEE1陰性患者死亡13例。與WEE1陰性患者比較，WEE1陽性患者5年生存率較差，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。WEE1陽性患者無瘤生存期低于WEE1陰性患者(P<0.05)。這與WEE1對臨床病理參數影響的結論相吻合。WEE1的陽性表達意味著更高的T分期與N分期，同時也可能導致脈管浸潤的發(fā)生率升高。這些不良因素共同作用，致使WEE1陽性患者預后明顯較差、無瘤生存期較短。相應地，WEE1陰性患者預后較好。

綜上所述，WEE1在胃癌中有較高的陽性率，且與胃癌分期密切相關，其陽性表達是患者預后不良的強烈信號。但本研究為單中心研究，樣本量較小，未來在多中心聯(lián)合的基礎上，實施更大樣本量的研究，或能得出更具說服力的證據。