趙暢，黃鳳祥，劉盈，彭強(qiáng)，張?chǎng)螣?，李瑞喆，苗麗?/p>

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.呼吸與危重癥二科;b.胸外科;c.病理科，河南 鄭州 450000)

肺腺癌是肺癌最常見(jiàn)的類型，約占肺癌的40%[1]，是導(dǎo)致患者高病死率的惡性腫瘤之一。雖然對(duì)其發(fā)生發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制方面的了解有了一定的進(jìn)展，并在臨床治療方法上取得了一些進(jìn)步，但常規(guī)放療和化療仍無(wú)法突破當(dāng)前治療的瓶頸。因此尋找可能參與肺腺癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)基因是肺癌基礎(chǔ)及臨床研究的當(dāng)務(wù)之急。DIAPH3基因位于人類13號(hào)常染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶，其產(chǎn)物屬于Formin蛋白家族。該蛋白可參與肌動(dòng)蛋白的重塑、細(xì)胞形態(tài)的變化、運(yùn)動(dòng)和黏附的調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)[2-3]。多項(xiàng)研究表明DIAPH3基因的表達(dá)量與聽(tīng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病和硅肺相關(guān)[4-5]，與乳腺癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移有關(guān)[3,6-10]。Guo等[11]發(fā)現(xiàn)DIAPH3是肺腺癌中的上調(diào)基因并促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。DIAPH3在肺癌中的研究較少，本文通過(guò)分析DIAPH3在癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床標(biāo)本中的表達(dá)情況，以期對(duì)腫瘤預(yù)后的判斷及臨床治療方案的制定起到一定的參考作用。

1 資料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中DIAPH3mRNA表達(dá)水平及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得肺腺癌患者DIAPH3mRNA表達(dá)水平及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，共495例原發(fā)性肺腺癌患者，其中328例記錄了完整數(shù)據(jù)。根據(jù)DIAPH3mRNA表達(dá)水平將肺腺癌患者分為DIAPH3mRNA低表達(dá)組(表達(dá)量低于8.152 FPKM)和mRNA高表達(dá)組(表達(dá)量高于8.152 FPKM)，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 肺腺癌患者臨床標(biāo)本收集2015年1—12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科術(shù)后肺腺癌組織和癌旁組織(距癌周>5 cm)標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)組織學(xué)病理確診為肺腺癌，病理結(jié)果由兩名中級(jí)以上職稱病理科醫(yī)生復(fù)核；(2)有詳細(xì)的隨訪信息；(3)無(wú)其他惡性腫瘤病史；(4)手術(shù)前未接受化療、免疫治療和放療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他肺部疾??；(2)疾病發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中伴有新生血管的疾病，如糖尿病等；(3)孕期或哺乳期。最終納入55例肺腺癌術(shù)后石蠟病理切片標(biāo)本和26例癌旁組織標(biāo)本。肺癌標(biāo)本中男26例，女29例，年齡44～77歲，按照第8版國(guó)際抗癌聯(lián)盟肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期17例。

1.3 免疫組化對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化處理，使用枸櫞酸鈉修復(fù)抗原后用H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，以BSA溶液封閉，血清封閉后孵育一抗、二抗。顯色、復(fù)染、脫水、封固后于鏡下觀察DIAPH3蛋白表達(dá)情況并選取視野拍照。免疫組化結(jié)果判讀：由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)DIAPH3蛋白染色的強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。(1)細(xì)胞著色的強(qiáng)度：細(xì)胞不著色為0分，著色淡為1分，著色適中為2分，著色深為3分。(2)著色細(xì)胞占比：著色細(xì)胞計(jì)數(shù)>0%～5%為0分；著色細(xì)胞計(jì)數(shù)>5%～25%為1分；著色細(xì)胞計(jì)數(shù)>25%～50%為2分；著色細(xì)胞計(jì)數(shù)>50%～<100%為3分。(3)計(jì)分：每張片子的平均著色程度得分乘以平均著色細(xì)胞占比得分，0～1分判定為陰性，記為等級(jí)0；2～3分判定為弱陽(yáng)性，記為等級(jí)1；4～6分判定為中度陽(yáng)性，記為等級(jí)2；>6分判定為強(qiáng)陽(yáng)性，記為等級(jí)3。本研究中取免疫組化評(píng)分等級(jí)0～1設(shè)為DIAPH3蛋白低表達(dá)組，等級(jí)2～3設(shè)為DIAPH3蛋白高表達(dá)組。

1.4 隨訪開(kāi)始于2015年1月，截止至2020年11月，獲得患者的總生存期(overall survival，OS)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以log-rank法分析DIAPH3表達(dá)水平與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，以χ2檢驗(yàn)分析DIAPH3蛋白表達(dá)情況，以單因素和多因素 Cox回歸分析影響患者預(yù)后的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)結(jié)果

2.1.1DIAPH3mRNA表達(dá)情況與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系DIAPH3mRNA低表達(dá)的肺腺癌患者的總生存率高于DIAPH3mRNA高表達(dá)的肺腺癌患者(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 DIAPH3 mRNA表達(dá)情況與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.1.2Cox單因素回歸DIAPH3mRNA表達(dá)水平、T分期、N分期、臨床分期與5 a生存率相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、M分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.1.3Cox多因素回歸 將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DIAPH3mRNA表達(dá)水平、T分期、N分期和臨床分期納入Cox多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)DIAPH3mRNA高表達(dá)、N1～3期、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期是肺腺癌患者OS的影響因素(P<0.05)，T分期不是OS的影響因素(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 臨床標(biāo)本結(jié)果

2.2.1DIAPH3蛋白在肺腺癌組織中表達(dá)情況 免疫組化發(fā)現(xiàn)DIAPH3蛋白在肺腺癌及癌旁組織中表達(dá)，定位在細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)果表明，腺癌組織DIAPH3蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.2.2DIAPH3蛋白表達(dá)情況與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 DIAPH3蛋白低表達(dá)的肺腺癌患者的總生存率高于DIAPH3蛋白高表達(dá)的肺腺癌患者(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

表1 TCGA中肺腺癌患者5 a生存率的單因素分析(n，%)

表2 TCGA中肺腺癌患者OS的多因素分析

表3 DIAPH3蛋白在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá) 水平比較[n(%)]

圖2 DIAPH3蛋白表達(dá)情況與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.2.3Cox單因素回歸 DIAPH3蛋白表達(dá)水平、N分期以及臨床分期與5 a生存率相關(guān)(P<0.05)，年齡、性別、T分期、M分期與5 a生存率無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 肺腺癌患者5 a生存率的單因素分析(n，%)

2.2.4Cox多因素回歸 將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DIAPH3蛋白表達(dá)水平、N分期和臨床分期納入Cox多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)DIAPH3蛋白高表達(dá)、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期是肺腺癌患者OS的影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 肺腺癌患者OS的多因素分析

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[12]。隨著靶向治療及免疫治療的不斷開(kāi)展與進(jìn)步，非小細(xì)胞肺癌已邁入“個(gè)體化治療”和“精準(zhǔn)治療”的新時(shí)代，越來(lái)越多的肺腺癌驅(qū)動(dòng)基因被發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的治療提供潛在靶點(diǎn)[13-15]。DIAPH3在多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中也扮演重要角色，它可以通過(guò)改變微管穩(wěn)定性影響細(xì)胞骨架進(jìn)而影響細(xì)胞的阿米巴表型[2]，具有阿米巴表型的腫瘤細(xì)胞通過(guò)改變自身形狀更易穿過(guò)周圍組織發(fā)生轉(zhuǎn)移。

本研究收集了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的495例原發(fā)性肺腺癌患者的DIAPH3mRNA表達(dá)情況及臨床數(shù)據(jù)，納入55例臨床肺腺癌術(shù)后石蠟病理切片標(biāo)本及26例癌旁組織標(biāo)本。對(duì)55例肺腺癌患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，DIAPH3在肺腺癌組織的細(xì)胞質(zhì)中陽(yáng)性率高于癌旁組織。研究發(fā)現(xiàn)DIAPH3mRNA在胰腺癌組織中高表達(dá)，免疫組化染色呈強(qiáng)表達(dá)[16]。Guo等[11]研究也發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞系中DIAPH3蛋白較正常支氣管細(xì)胞表達(dá)高，與本研究結(jié)果一致。DIAPH3在肺腺癌疾病診斷和治療中具有一定的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，可能促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生。

關(guān)于DIAPH3基因?qū)Ψ蜗侔┗颊呱骖A(yù)后的影響，本研究發(fā)現(xiàn)DIAPH3mRNA或蛋白高表達(dá)的肺腺癌患者預(yù)后更差，高表達(dá)患者的總生存率低于低表達(dá)患者。這與Nishida等[16]研究發(fā)現(xiàn)DIAPH3高表達(dá)的胰腺癌患者的OS更短一致，可能與DIAPH3參與肌動(dòng)蛋白重塑和調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附，導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲或轉(zhuǎn)移引起的預(yù)后不良有關(guān)。因此，DIAPH3基因有望成為肺腺癌腫瘤診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的新的生物標(biāo)志物，并可作為肺腺癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步分析影響肺腺癌預(yù)后的因素，本研究納入年齡、性別、DIAPH3表達(dá)情況、臨床病理特征等數(shù)據(jù)，探討患者OS的危險(xiǎn)因素。TCGA結(jié)果顯示，DIAPH3mRNA表達(dá)水平、T分期、N分期、臨床分期與5 a生存率相關(guān)，臨床結(jié)果顯示，DIAPH3蛋白表達(dá)水平、N分期和臨床分期與5 a生存率相關(guān)。DIAPH3mRNA或蛋白高表達(dá)、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期是患者OS的影響因素。在臨床上腫瘤T、N、M分期是影響患者生存的重要因素，但在本研究中臨床患者的部分指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與臨床患者未能及時(shí)獲得治療、樣本數(shù)據(jù)量過(guò)小、混雜因素較多有關(guān)。此外，本研究為回顧性研究，對(duì)不同干預(yù)措施的效果未進(jìn)行分析，尚需開(kāi)展前瞻性研究進(jìn)一步確定，能否將DIAPH3基因作為肺腺癌新的預(yù)后標(biāo)志物仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)、臨床患者免疫組化實(shí)驗(yàn)研究DIAPH3基因在肺腺癌中的表達(dá)情況，并對(duì)患者臨床特征及預(yù)后進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)臨床標(biāo)本中肺腺癌組織的DIAPH3蛋白表達(dá)水平較癌旁組織高，DIAPH3mRNA或蛋白水平高表達(dá)和臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的患者的預(yù)后更差，是OS的影響因素，提示DIAPH3基因可能參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，DIAPH3基因有望成為肺腺癌診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的新的生物標(biāo)志物，并可作為肺腺癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。