馬蔓蔓1,2 ， 周會鴿2 ， 陳春英2 ， 曹新鑫1

(1.河南理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院 ， 河南 焦作 454000 ； 2.國家納米科學(xué)中心 ， 北京 100190)

超小超順磁氧化鐵納米顆粒由于其獨(dú)特的磁學(xué)特性，優(yōu)異的生物相容性及良好的長期穩(wěn)定性等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于核磁共振成像、磁熱治療、細(xì)胞示蹤和篩選等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1]。雖有許多文獻(xiàn)報道納米氧化鐵各種不同的制備方法，但其本身精巧的設(shè)計和復(fù)雜的制備及純化方法導(dǎo)致反應(yīng)體系難以放大，嚴(yán)重限制了它們進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)及走向臨床。共沉淀法由于設(shè)備簡易、操作方便和原料廉價易得而被研究人員廣泛采納，但其所制備納米顆粒的均一性和穩(wěn)定性受到了極大的挑戰(zhàn)[2]。

透明質(zhì)酸(HA)是維持皮膚結(jié)構(gòu)和功能的一種生物可降解的糖胺聚糖，安全性良好[3]。HA優(yōu)異的水溶性和生物相容性使其成為改善無機(jī)納米顆粒在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性的良好選擇[4]。本文選擇了HA為親水性配體和阻隔劑來調(diào)控納米氧化鐵的尺寸及穩(wěn)定性，設(shè)計思路如圖1所示。通過改變HA、氨水與鐵離子的比例，反應(yīng)物濃度、溫度和體積等參數(shù)，采用共沉淀法合成了Fe3O4@HA納米顆粒，并通過觀測樣品的水合粒徑，透射電鏡圖像和磁滯回線等方法，探討了反應(yīng)參數(shù)對Fe3O4@HA納米顆粒的水合粒徑、形貌和飽和磁化率的影響，并探索了該反應(yīng)體系是否具備放大生產(chǎn)的潛力。

圖1 Fe3O4@HA納米顆粒設(shè)計思路

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

化學(xué)試劑：FeCl3· 6H2O、FeCl2· 4H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；透明質(zhì)酸，HA，Mw=9 kDa，華熙生物科技股份有限公司；濃氨水，西安天茂化工有限公司，分析純。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：透射電子顯微鏡，TEM,Tecnai G2 F20 U-TWIN，F(xiàn)EI Company，USA；Ultrapure Milli-Q 純水儀，UPP-11-10T；納米粒度及ζ電位分析儀，Zetasizer Nano ZS,Malvern Instruments Ltd,UK；振動樣品磁強(qiáng)計，Quantum Design PPMS Dyna Cool；電感耦合等離子光譜儀，ICP-OES,PE8000,perkinElmer,USA。

1.2 超小納米氧化鐵的制備

HA修飾的納米氧化鐵(Fe3O4@HA)的制備方法與文獻(xiàn)相似[5]。1.5 g HA溶解在50 mL去離子水中，油浴升溫至80 ℃，同時鼓入氮?dú)?0 min以去除反應(yīng)體系中的氧氣。在磁力攪拌下，將溶解在稀鹽酸(2 mL，1.0 M)中的FeCl3· 6H2O (0.145 9 g，0.54 mmol)和FeCl2· 4H2O (0.071 5 g，0.36 mmol)快速注射入熱的HA水溶液中。隨后，逐滴加入濃氨水(15 mL，28%)，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值為9～10。反應(yīng)液在氮?dú)夥諊禄亓?0 min，然后冷卻至室溫，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留相對分子質(zhì)量20 kDa的透析袋，在去離子水中透析72 h (換水8次)，以除去沒有反應(yīng)的雜質(zhì)。完成透析后，將透析袋內(nèi)的液體過0.22 μm的濾膜并收集在一個玻璃瓶中，存放于4 ℃冰箱中備用。其他制備方法與前述類似，但通過改變HA、氨水與鐵離子的比例，反應(yīng)溫度、反應(yīng)物濃度和反應(yīng)體系大小等反應(yīng)參數(shù)來探究Fe3O4@HA納米粒子尺寸、形貌和飽和磁化率的影響因素。

1.3 超小納米氧化鐵的表征

水合粒徑測量：將不同反應(yīng)條件下制備的Fe3O4@HA膠體溶液分散到去離子水中，使樣品濃度為40 μg/mL左右，超聲后用納米粒度分析儀進(jìn)行測量。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

穩(wěn)定性：連續(xù)兩周每天定點(diǎn)取樣，測水合粒徑并記錄，一年后再重復(fù)測量。

TEM表征形貌：將一定濃度的Fe3O4@HA滴加到普通碳支持膜上呈現(xiàn)球型水珠，5 min后吸除液體，放37 ℃恒溫箱過夜即可進(jìn)行TEM表征。

磁滯回線：取一些Fe3O4@HA液體凍干并記錄質(zhì)量，用振動樣品磁強(qiáng)計測定磁滯回線。

ICP-OES：取50 μL Fe3O4@HA液體，加入雙氧水和濃硝酸進(jìn)行消解，并最終用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的稀硝酸定容到3 mL，測定ICP-OES。

2 結(jié)果和討論

Fe3O4@HA納米顆粒是通過Fe3+和Fe2+在濃氨水的作用下，以熱的聚合物溶液為反應(yīng)介質(zhì)，通過共沉淀法合成的。磁性氧化鐵的形成共分為兩個階段，成核階段和生長階段[6]。隨著納米材料尺寸的減小，會出現(xiàn)一些獨(dú)特的性質(zhì)，例如小尺寸納米氧化鐵會出現(xiàn)超順磁現(xiàn)象，可以使磁性納米氧化鐵完全受外加磁場的調(diào)控，沒有磁滯現(xiàn)象[7]。此外，磁性納米顆粒的尺寸和形貌在藥物負(fù)載和運(yùn)輸?shù)确矫嬗兄匾膽?yīng)用意義[8]。HA的投入量、反應(yīng)溫度、氨水用量、反應(yīng)物濃度等反應(yīng)參數(shù)分別影響著Fe3O4@HA納米顆粒的穩(wěn)定性、反應(yīng)進(jìn)程、生長尺寸、成核速率等[1,6,9]。這些反應(yīng)參數(shù)相輔相成共同影響Fe3O4@HA納米顆粒的尺寸和形貌。

2.1 調(diào)控HA的投入量

HA在反應(yīng)過程中發(fā)揮了阻隔劑和穩(wěn)定劑的作用，對Fe3O4@HA的粒徑及穩(wěn)定性有重要影響。通過調(diào)控HA的用量，所制備Fe3O4@HA的水合粒徑及多分散指數(shù)發(fā)生明顯變化。如圖2所示，隨著HA投入量的增加，F(xiàn)e3O4@HA的水合粒徑先減小后略微增加。當(dāng)HA的投入量>1.5 g時，F(xiàn)e3O4@HA的水合粒徑保持在50 nm以下，當(dāng)投入量<1.5 g時水合粒徑卻大于50 nm。HA 用量少時，不足以削弱磁性氧化鐵納米粒子間的作用力，顆粒易聚集，導(dǎo)致水合粒徑增加，在透射電鏡下也呈現(xiàn)出團(tuán)聚的現(xiàn)象。當(dāng)HA投入量為3 g時，可從透射電鏡圖像(圖2b)中觀察到納米顆粒雖然分散性較好，但邊界模糊，這是由于納米顆粒表面包裹太多配體的緣故。同時，溶液中多余的HA會通過橋聯(lián)作用使納米顆粒發(fā)生不同程度的聚集，從而使多分散指數(shù)提高[10]。Fe3O4@HA 的飽和磁化率并未隨HA投入量的變化而發(fā)生明顯變化，穩(wěn)定在55～80 emu/g；ζ電位也一直保持在-20 mV以下，保證了納米粒子的穩(wěn)定性。HA投入量對產(chǎn)品水合粒徑的影響見表1。

表1 HA投入量對產(chǎn)品水合粒徑的影響

圖2 調(diào)控HA投入量對產(chǎn)品水合粒徑的影響

本實(shí)驗(yàn)說明：HA的投入量可影響Fe3O4@HA納米粒子的分散狀態(tài)，但對飽和磁化率和ζ電位影響較小，且其它條件不變的情況下，HA的最佳投入量為1.5 g。

2.2 調(diào)控反應(yīng)溫度

在幾乎所有的化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)溫度都發(fā)揮著重要作用。同樣，對于氧化鐵納米顆粒的成核和生長，溫度也具有重要影響[11]。為探究溫度對共沉淀法制備Fe3O4@HA顆粒的影響，保持其他條件不變，增加反應(yīng)體系溫度，并對所制備樣品進(jìn)行表征，見表2及圖3。

由表2可知，隨著溫度從60 ℃增加到80 ℃，F(xiàn)e3O4@HA的水合粒徑從86 nm減小到42 nm。這是因?yàn)殡S溫度升高，HA分子及其所結(jié)合的三價鐵離子運(yùn)動速率增加，加快了它們參與Fe3O4結(jié)晶的速度，阻隔了Fe3O4納米粒子的進(jìn)一步生長，從而減小了顆粒尺寸。而80 ℃與102 ℃差別不大，則說明溫度對納米顆粒影響的閾值≤80 ℃。

表2 反應(yīng)溫度對產(chǎn)品水合粒徑的影響

由圖3a可以看出，不同溫度形成的Fe3O4@HA納米粒子的磁滯回線表明，隨著反應(yīng)溫度的升高合成的磁性氧化鐵納米顆粒飽和磁化率輕微下降，但仍在55～80 emu/g。考慮到溫度越高對反應(yīng)設(shè)備的要求越高，本實(shí)驗(yàn)所確定的最佳反應(yīng)溫度是80 ℃。

圖3 調(diào)控溫度對產(chǎn)品水合粒徑影響表征

2.3 調(diào)控氨水用量

表3 氨水用量對產(chǎn)品水合粒徑的影響

由表3可知，當(dāng)氨水的投入量從5 mL增加到15 mL時水合粒徑明顯減??；當(dāng)再增加氨水的濃度，使氨水投入量從15 mL增加到25 mL時，F(xiàn)e3O4@HA沒有持續(xù)變小。這是因?yàn)楫?dāng)氨水濃度低時，溶液中少量的Fe3+和Fe2+能夠和OH-結(jié)合成核，其他游離的鐵離子參與納米粒子生長的過程，從而形成較大尺寸的納米粒子；當(dāng)氨水濃度增加時，溶液中的Fe3+和Fe2+能夠充分和OH-結(jié)合，形成爆發(fā)式成核，參與Fe3O4@HA晶體成長的鐵離子變少，進(jìn)而形成小尺寸納米粒子；進(jìn)一步增加氨水的投入量時，會使Fe3O4@HA納米粒子的水合粒徑有所增加[13]。

圖4b透射電鏡圖像進(jìn)一步證明了該現(xiàn)象。由圖4a可知，調(diào)控氨水的加入量對飽和磁化率影響較小，且其值穩(wěn)定在55～80 emu/g。本實(shí)驗(yàn)最佳的氨水加入量為15 mL。

圖4 調(diào)控氨水體積對產(chǎn)品水合粒徑影響表征

2.4 調(diào)控反應(yīng)物濃度

為了觀察能否提高納米氧化鐵的單位體積內(nèi)產(chǎn)量，在保持其他條件不變的情況下，增加鐵離子、氨水和HA的投入量，觀察其對Fe3O4@HA粒徑的影響，結(jié)果見表4和圖5。

由表4可知，當(dāng)維持反應(yīng)體積50 mL不變，增加原料投入量為原來3倍時，水合粒徑大小及透射電鏡下觀察到的形貌幾乎沒有變化，F(xiàn)e3O4@HA的ζ電位和磁滯回線(圖5a)也幾乎不受影響。這說明該反應(yīng)體系能夠提升單位體積內(nèi)的納米氧化鐵產(chǎn)量，具備大規(guī)模制備的潛力。

表4 反應(yīng)物濃度對產(chǎn)品水合粒徑的影響

圖5 調(diào)控反應(yīng)物濃度對粒徑影響表征

2.5 調(diào)控反應(yīng)體系大小

目前，在超小納米氧化鐵的制備中，大規(guī)模生產(chǎn)還是一項(xiàng)未完成的挑戰(zhàn)。隨著反應(yīng)體積的增加，合成磁性納米氧化鐵的尺寸可控性變差。為驗(yàn)證本反應(yīng)體系能否放大，在保持其他條件不變的情況下，等比例擴(kuò)大反應(yīng)體系，來觀察納米顆粒的尺寸，形貌和飽和磁化率。反應(yīng)體積對產(chǎn)品水合粒徑的影響見表5和圖6。由表5及圖6可知，雖然反應(yīng)體系進(jìn)行一系列的放大，但Fe3O4@HA納米粒子的尺寸、磁滯回線、形貌仍可與小反應(yīng)體系保持一致。由此證明該反應(yīng)體系在反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)物濃度比例保持不變，進(jìn)行等比例放大時，也能得到實(shí)驗(yàn)室級別反應(yīng)所具有的超小氧化鐵的尺寸，證明該反應(yīng)具備工業(yè)化的潛力。

表5 反應(yīng)體積對產(chǎn)品水合粒徑的影響

圖6 調(diào)控反應(yīng)體積對粒徑影響表征

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該反應(yīng)的大規(guī)模制備潛力，在反應(yīng)體系體積為500 mL的基礎(chǔ)上將反應(yīng)物的濃度增加3倍，并對所得樣品進(jìn)行純化，得到2 L的Fe3O4@HA膠體溶液(圖7f)。為了證明該放大方法對Fe3O4@HA納米顆粒理化性質(zhì)的影響較小，對所得到的納米顆粒進(jìn)行表征，結(jié)果如圖7所示。由圖7a傅里葉紅外光譜圖可以看出，在596 cm-1處出現(xiàn)了Fe—O特征峰，證明氧化鐵納米顆粒的合成；且在1 033 cm-1和1 613 cm-1處又分別出現(xiàn)了HA上伯醇C—O的伸縮振動峰和—COO—的反對稱伸縮振動峰，證明放大反應(yīng)對HA在Fe3O4納米顆粒上的包覆幾乎沒有影響。此外，所得到的Fe3O4@HA納米粒子的尺寸仍在40 nm左右(圖7b)，飽和磁化率為58.8 emu/g(圖7d)，與小反應(yīng)體系所制備的Fe3O4納米顆粒保持相近的水合動力學(xué)尺寸和磁學(xué)性質(zhì)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該放大方法對Fe3O4納米顆粒穩(wěn)定性的影響，我們進(jìn)行了為期1年的穩(wěn)定性測試，結(jié)果表明，該納米顆粒的膠體溶液可穩(wěn)定至少1年。

3 結(jié)論

在初始反應(yīng)體積為50 mL的反應(yīng)體系中控制HA用量為1.5 g，溫度80 ℃，氨水15 mL時，可制備出水合粒徑約40 nm，飽和磁化率為-60 emu/g的超小超順磁Fe3O4@HA納米顆粒。在該反應(yīng)條件下，增加反應(yīng)物濃度和反應(yīng)體積，可成功制備出和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下相似的Fe3O4@HA納米顆粒，證明該反應(yīng)體系具備放大生產(chǎn)的潛力。本文能夠?yàn)槭褂霉渤恋矸ㄖ苽渚?、穩(wěn)定的納米氧化鐵和其他無機(jī)納米顆粒及它們的大規(guī)模制備提供借鑒。

圖7 放大制備的Fe3O4@HA納米顆粒