徐慧，崔穎，王珊珊，田延軍，賀強之，韓延雷，劉建軍*，朱坤福，祝蕾，姜國政

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東濟南250013；2.山東朱氏藥業(yè)集團有限公司，山東菏澤274300；3.煙臺恒源生物股份有限公司，山東煙臺265709）

L-丙氨酸，又名L-2-氨基丙酸，是一種具有重要生理功能的非必需氨基酸，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，并有日益增長的趨勢[1-2]。食品應(yīng)用方面，L-丙氨酸具有甜味與鮮味，被用于食品添加劑，改善食品風(fēng)味并強化營養(yǎng)，此外其還具有較強的防腐保鮮功能，被用作防腐劑[3-6]。醫(yī)藥應(yīng)用方面，L-丙氨酸是復(fù)合氨基酸注射液的組成成分之一，是合成維生素B5、維生素B6、L-氨基丙醇（鹽酸左氧氟沙星）和抗癌藥4-羥基水楊醛丙氨酸合鋅的前體物質(zhì)[7-8]。此外，L-丙氨酸可用于合成具有光學(xué)活性的聚合物，在生物醫(yī)學(xué)、液晶、手性催化等領(lǐng)域具有重要的價值[9]。

L-丙氨酸可以通過提取法、化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法進行制備。其中，酶法轉(zhuǎn)化是目前工業(yè)上的主要生產(chǎn)方法，即利用L-天冬氨酸-β-脫羧酶（L-aspartate-β-decarboxylase，Asd）以L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）為原料經(jīng)脫羧生成L-丙氨酸。1951 年，MEISTER 等[10]首次發(fā)現(xiàn)了韋爾奇梭菌（Clostridiumn welchii）能催化L-Asp 合成L-丙氨酸。隨后國內(nèi)外很多研究人員對此法生產(chǎn)L-丙氨酸進行了深入的研究。SHIBATANI 等[11]以Pseudomonas dacunhae 為產(chǎn)酶菌株，研究不同氨基酸作為氮源對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸誘導(dǎo)后產(chǎn)酶量是未添加L-谷氨酸的2 倍。徐虹等[12]通過誘變育種獲得一株高Asd 活性的菌株P(guān)seudomonas NX-1，每升培養(yǎng)液可轉(zhuǎn)化L-Asp 達1.4 kg，L-丙氨酸含量可達到90%以上，摩爾轉(zhuǎn)化率接近100%。儲瑞藹等[13]對產(chǎn)酶菌株P(guān).dacunhae CPU9001進行了固定化，并優(yōu)化了其催化L-Asp 合成L-丙氨酸的發(fā)酵條件，每1 kg 固定化細(xì)胞可轉(zhuǎn)化2 kg 底物，轉(zhuǎn)化率大于98%，產(chǎn)物收率大于85%，固定化細(xì)胞酶活半衰期大于80 d，產(chǎn)品純度大于98.5%。周麗等[14]以大腸桿菌為出發(fā)菌株，敲除編碼乳酸、甲酸、乙酸、乙醇、琥珀酸和丙氨酸消旋酶的基因，導(dǎo)入嗜熱脂肪芽孢桿菌（Geobacillus stearothmophilus）來源的L-丙氨酸脫氫酶基因（alaD），構(gòu)建的重組菌以初始濃度30 g/L 的葡萄糖作碳源，經(jīng)補料發(fā)酵得到67.2 g/L L-丙氨酸。徐友強等[7]將來源于睪丸酮叢毛單胞菌的Asd 基因克隆至大腸埃希氏菌CICC11022S 中，構(gòu)建了一株轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L-丙氨酸的重組工程菌，該菌9 h 轉(zhuǎn)化富馬酸生成112.7 g/L 產(chǎn)物，生產(chǎn)速率為12.5 g/（L·h），轉(zhuǎn)化率為93.8%。

Asd 是至今在自然界中唯一的氨基酸-β-脫羧酶，以5′-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5′-phosphate，PLP）為輔酶因子，是L-丙氨酸合成的關(guān)鍵酶[15]。汪芳[16]實現(xiàn)了P. dacunhae 來源的Asd（aspD）基因在大腸桿菌中的異源表達，通過定點突變改善了該酶在酸性環(huán)境中的催化能力，獲得組合突變體酶N34D/L484M，酶比活力達116.27 U/mg，比原始酶提高了76.30%。于封印等[17]首次在大腸桿菌中異源表達不動桿菌來源Asd，對其酶學(xué)性質(zhì)進行分析，為工業(yè)生產(chǎn)L-丙氨酸提供參考。Asd 在德阿昆哈假單胞菌（Pseudomonas dacunhae）[18]、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）[19]、糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）[20]、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）[21]、小球諾卡氏菌（Nocardia globerula）[22]等微生物中均有存在，但由于產(chǎn)酶菌株產(chǎn)酶量低、酶活性低，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，因此，選育Asd 高產(chǎn)菌株、優(yōu)化發(fā)酵條件和提高酶活力是酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-丙氨酸的關(guān)鍵。

本研究在前期通過菌種誘變選育出一株高產(chǎn)Asd的L-丙氨酸轉(zhuǎn)化菌，本文對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，旨在為生物合成L-丙氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)研究提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

睪丸酮叢毛單胞菌株HY-08D （CGMCC No.6083）：煙臺恒源生物股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面及平板培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH 7.0～7.2。

液體培養(yǎng)基：玉米漿干粉0.8%，蛋白胨0.8%，磷酸二氫鉀0.15%，氯化鈉0.5%，硫酸鎂0.1%，pH 7.0～7.2。

1.1.3 試劑

酵母膏、牛肉膏、玉米漿、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；玉米漿干粉（生化試劑）：山東康源生物科技有限公司；富馬酸（分析純）：煙臺恒源生物有限公司；氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XNP-9052BS-III 生化培養(yǎng)箱、XL-YC 恒溫?fù)u床：上海馨朗電子科技有限公司；722 型分光光度計：上海天普分析儀器有限公司；LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；PY-P10 pH 計、BSA124S-C 電子分析天平：德國賽多利斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：接一環(huán)生長良好的斜面種子至500 mL（裝液量50 mL）錐形瓶中，180 r/min，30 ℃，培養(yǎng)12 h～24 h。

搖瓶培養(yǎng)：將種子液按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量轉(zhuǎn)接至500 mL（裝液量50 mL）錐形瓶中，180 r/min，培養(yǎng)12 h～24 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將種子液按0.1%～10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐（裝液量70%）中，150 r/min，培養(yǎng)12 h～24 h。

1.3.2 菌株生長情況測定

發(fā)酵液稀釋10 倍，在640 nm 測定吸光度值，以O(shè)D640代表菌株生長情況。

1.3.3 酶活的測定

取25 mL 發(fā)酵液，加入1 g L-Asp，用0.l mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 5.0，在37 ℃水浴搖床中振蕩30 min，微波爐加熱1 min，終止反應(yīng)，利用紙層析法分析反應(yīng)液中L-丙氨酸的含量，計算酶活。每小時催化消耗l μmol LAsp 的酶量定義為一個酶活單位（U）。

1.3.4 培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.4.1 碳源優(yōu)化

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基其余組分和培養(yǎng)條件不變的情況下，以1%的比例，分別添加富馬酸、L-Asp、谷氨酸和葡萄糖作為發(fā)酵產(chǎn)酶的碳源，以原始培養(yǎng)基為對照考察其對菌株HY-08D 生長及產(chǎn)酶的影響。通過L9（34）正交試驗設(shè)計對以上4 種碳源添加量進行優(yōu)化。正交試驗設(shè)計因素與水平如表1 所示。

表1 菌株HY-08D 碳源正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment ofcarbon sources by HY-08D strain

1.3.4.2 氮源、氯化鈉和pH 值優(yōu)化

在優(yōu)化碳源基礎(chǔ)上，控制其它條件不變，以0.8%的比例，分別添加玉米漿干粉、酵母粉和蛋白胨作為發(fā)酵的氮源，考察其對菌株HY-08D 生長及產(chǎn)酶的影響。通過正交試驗對2 種氮源添加量、氯化鈉添加量和pH 值的水平進行優(yōu)化。正交試驗設(shè)計因素與水平如表2 所示。

1.3.4.3 擴培級數(shù)和接種量優(yōu)化

采用三級擴培，一級采用搖瓶培養(yǎng)，二級采用2 m3發(fā)酵罐，二級培養(yǎng)液分別按0.1%、1.0%、5.0%和10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量轉(zhuǎn)接至20 m3發(fā)酵罐（裝液量為70%）中，150 r/min，30 ℃，培養(yǎng)24 h，每2 h 取樣測定OD640和酶活。

表2 菌株HY-08D 氮源、氯化鈉和pH 值正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels in orthogonal experiment of nitrogen sources,NaCl and pH by HY-08D strain

1.3.4.4 通氣量優(yōu)化

按照優(yōu)化后配方配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)液按10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量轉(zhuǎn)接至50 L（裝液量42.5 L）發(fā)酵罐中培養(yǎng)，150 r/min，30 ℃，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)初始pH 6.0，設(shè)置通氣量分別為6、8、10、12、14 L/min，考察其對菌株HY-08D 生長和產(chǎn)酶的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

正交試驗采用正交設(shè)計助手V3.1 軟件通過直觀分析對菌株HY-08D 培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，其它數(shù)據(jù)采用Origin8.1 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源優(yōu)化

2.1.1 碳源種類對菌株HY-08D 生長及產(chǎn)酶的影響

碳源種類對菌株HY-08D 生長及產(chǎn)酶的影響見圖1。

圖1 碳源對菌株HY-08D 生長及產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on the growth and enzyme production by HY-08D strain

從圖1 可以看出，在添加量相同的條件下，選擇富馬酸、L-Asp、谷氨酸和葡萄糖作為碳源，OD640均有所增加，以谷氨酸為碳源時菌體生長最好，以L-Asp 為碳源時，酶活最高。

2.1.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表3。

表3 菌株HY-08D 碳源添加正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of carbon sources addition by HY-08D strain

從表3 可以看出，影響菌株HY-08D 生長的因子順序為：谷氨酸添加量＞L-Asp 添加量＞葡萄糖添加量＞富馬酸添加量，影響菌株HY-08 產(chǎn)酶的因子順序為：L-Asp 添加量＞谷氨酸添加量＞富馬酸添加量＞葡萄糖添加量；結(jié)合k 值，適合菌株HY-08D 生長的最佳組合為A1B2C2D3；適合菌株HY-08D 產(chǎn)酶的最佳組合為A2B2C2D3。葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酶影響最小，不再考慮添加，而富馬酸添加量對菌株產(chǎn)酶的影響比其對生長的影響要大，綜合考慮，最佳碳源組合為A2B2C2，即富馬酸1%，L-Asp 1%，谷氨酸1%。在最佳碳源組合下進行驗證試驗，OD640達到0.536，酶活達到53 927 U/mL，均高于正交試驗中各試驗組，表明優(yōu)化后碳源有利于菌株生長和產(chǎn)酶。

2.2 氮源、氯化鈉和pH 值優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 氮源種類對菌株HY-08D 生長及產(chǎn)酶的影響

氮源種類對菌株HY-08D 生長及產(chǎn)酶的影響見圖2。

圖2 氮源對菌株HY-08D 生長和產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the growth and enzyme production by HY-08D strain

從圖2 可以看出，在添加量相同的條件下，單獨添加蛋白胨不利于菌株生長，酶活力較低；單獨添加玉米漿干粉和酵母粉，OD640和酶活相對較高，因此，針對兩者復(fù)合的添加量做了進一步分析以確定最佳配比。除了培養(yǎng)基組分外，適宜的初始pH 值也是十分重要的。Asd 進行脫羧反應(yīng)時，酸性底物（如L-Asp）的加入會引起反應(yīng)液pH 值升高，不利于菌株生長，導(dǎo)致酶活力下降甚至失活。

2.2.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表4。

從表4 可以看出，影響菌株HY-08D 生長的因子順序為：pH 值＞玉米漿干粉添加量＞氯化鈉添加量＞酵母粉添加量；影響菌株HY-08D 產(chǎn)酶的因子順序為：pH 值＞氯化鈉添加量＞酵母粉添加量＞玉米漿干粉添加量。結(jié)合k 值，適合菌株HY-08D 生長的最佳組合為A1B1C1D2；適合菌株HY-08D 產(chǎn)酶的最佳組合為A3B2C3D2。玉米漿干粉添加量對菌株生長的影響比其對產(chǎn)酶的影響較大，而酵母粉和氯化鈉添加量對菌株產(chǎn)酶的影響比其對生長的影響較大，綜合考慮，最佳氮源、氯化鈉添加量及pH 值組合為A1B2C3D2，即玉米漿干粉0.6%，酵母粉0.8%，氯化鈉0.7%，pH 6.0。在最佳培養(yǎng)基組合下進行驗證試驗，OD640達到0.698，酶活達到54 837 U/mL，均高于正交試驗中各試驗組，表明優(yōu)化后的培養(yǎng)基可以提高單位體積培養(yǎng)液中菌體濃度和酶活力。

2.3 擴培級數(shù)和接種量優(yōu)化

不同接種量下菌株HY-08D 三級培養(yǎng)液的生長曲線和酶活曲線分別見圖3 和圖4。

表4 菌株HY-08D 氮源、氯化鈉和pH 值的正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of nitrogen sources，NaCl and pH by HY-08D strain

圖3 不同接種量下菌株HY-08D 三級培養(yǎng)液生長曲線Fig.3 The growth curve of the third stage culture solution by HY-08D strain

圖4 不同接種量下菌株HY-08D 三級培養(yǎng)液酶活曲線Fig.4 The enzyme activity curve of the third stage culture solution by HY-08D strain

微生物發(fā)酵種子培養(yǎng)通常采用逐級擴培的方式，但在實際生產(chǎn)中，為了降低接種過程染菌風(fēng)險，通常采用二級或三級放大。目前，丙氨酸生產(chǎn)中，產(chǎn)酶菌株HY-08D 轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)液采用二級培養(yǎng)，一級利用搖瓶培養(yǎng)，二級利用發(fā)酵罐培養(yǎng)，接種量只有0.1%，培養(yǎng)周期需要16 h～20 h。因此，本研究對擴培級數(shù)和接種量進行了優(yōu)化，從圖3 和圖4 可以看出，增加接種量不僅可以縮短菌株生長周期，還可以提高單位發(fā)酵液中的Asd酶活。在整個培養(yǎng)階段，接種量為10%時，培養(yǎng)周期相較于二級擴培縮短了6 h～8 h，酶活提高了約1 倍。

2.4 通氣量優(yōu)化

通氣量對菌株HY-08D 發(fā)酵過程的影響見表5。

表5 通氣量對菌株HY-08D 發(fā)酵過程的影響Table 5 Effects of aeration on the fermentation of HY-08D strain

L-丙氨酸轉(zhuǎn)化菌是好氧菌，需通氣培養(yǎng)，通氣量主要影響培養(yǎng)液的溶氧，進而影響菌株生長代謝。從表5 可以看出，通氣量對菌株HY-08D 培養(yǎng)周期和OD 值影響不明顯，而對pH 值和酶活影響顯著。通氣量為10 L/min 時，酶活達到5.51×104U/mL，但繼續(xù)增加通氣量并不會提高酶活力。因此，菌株HY-08D 發(fā)酵過程中最適通氣量為10 L/min。

3 結(jié)論

本研究通過單因素及正交試驗對睪丸酮叢毛單胞菌HY-08D 培養(yǎng)基進行優(yōu)化，獲得最佳培養(yǎng)基配方：富馬酸1.0%，L-Asp 1.0%，谷氨酸1.0%，玉米漿干粉0.6%，酵母粉0.8%，氯化鈉0.7%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.1%，pH 6.0。通過轉(zhuǎn)接試驗，確定了菌株HY-08D 轉(zhuǎn)化液采用三級擴培，三級種子的最佳接種量為10%，發(fā)酵過程中最適通氣量為10 L/min。在上述最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，優(yōu)化后培養(yǎng)液中HY-08D 菌體量和酶活較初始提高約1 倍，培養(yǎng)周期縮短6 h～8 h，為實現(xiàn)L-丙氨酸的高效轉(zhuǎn)化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。