于甜樂(lè)，馬 晗，吳新華，陳章榮，孫 彪，彭 媛，劉 宏*

(1.大理大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省滇東北區(qū)域醫(yī)療中心 呼吸內(nèi)科，云南 昭通 657000;3.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，云南 大理 671000；4.云南省跨高原心血管疾病防治工程研究中心，云南 大理 671000； 5.大理大學(xué) 跨高原心血管疾病防治研究所，云南 大理 671000)

血管緊張素2(angiotensin2，Ang2)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性肽，在體內(nèi)過(guò)量表達(dá)給心血管系統(tǒng)帶來(lái)了不利影響。多項(xiàng)研究[1-2]表明，Ang2誘導(dǎo)的心血管疾病過(guò)程中有自噬的參與。細(xì)胞自噬本質(zhì)上是指細(xì)胞內(nèi)異常的細(xì)胞器、折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)被溶酶體降解為氨基酸等小分子物質(zhì)并再次利用的過(guò)程，是細(xì)胞的自我更新和修復(fù)的過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞遭受到饑餓、缺氧、代謝異常等胞內(nèi)外刺激后，細(xì)胞發(fā)生自噬，在一定程度上維持細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡，是一種經(jīng)典的維持細(xì)胞生存的機(jī)制[3]。自噬的調(diào)節(jié)與心臟疾病密切相關(guān)，參與了包括心肌病、心臟肥大、缺血性心臟病、心力衰竭以及缺血-再灌注損傷等過(guò)程。心肌正常運(yùn)轉(zhuǎn)依賴于基礎(chǔ)水平的細(xì)胞自噬，但過(guò)度自噬會(huì)使心肌細(xì)胞死亡，加快心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[4]。miRNA是內(nèi)源性(<22個(gè)核苷酸組成)單鏈非編碼RNA，與目標(biāo)mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，參與心肌細(xì)胞中多種病理生理過(guò)程，對(duì)心血管疾病的啟動(dòng)和進(jìn)展有重要的影響[5]。miR-30a表達(dá)與自噬相關(guān)，且負(fù)向調(diào)控自噬[6]。miR-30家族可通過(guò)自噬參與心血管疾病相關(guān)的心室重構(gòu)，體外研究發(fā)現(xiàn)miR-30a通過(guò)下調(diào)Beclin-1的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞自噬[7]。本研究在細(xì)胞水平上探討miR-30a對(duì)Ang2誘導(dǎo)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基和DMEM/高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；引物、RT試劑和熒光定量PCR試劑(Western Biotechnology公司)；血管緊張素2(Sigma-Aldrich公司)；LC3(兔來(lái)源)一抗、Beclin-1(兔來(lái)源)一抗和GAPDH(兔來(lái)源)一抗(Abcam公司)；山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠IgG二抗(Sigma-Aldrich公司)；羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的miR-30a mimics和miR-30a inhibitor (上海吉瑪公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：將H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為對(duì)照組、Ang2(2×10-6mol/L的Ang2配制液)組、NE(5×10-6mol/L的NE配制液)陽(yáng)性對(duì)照組、Ang2+miR-30a mimics組、Ang2+miR-30a inhibitor組、Ang2+miR-NC組。Ang2和NE組均處理48 h，miR-30a mimic、miR-30a inhibitor和miR-NC先轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，將H9c2細(xì)胞接種至孔板中，把Lipofectamine 2000稀釋液和siRNA稀釋液輕柔混勻，室溫下孵育20 min形成siRNA-Lipofectamine 2000混合物，將混合物加入各孔中后放入37 ℃培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染6 h，更換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染成功后予2×10-6mol/L的Ang2處理48 h。拍照并收集樣本。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)miR-30a mRNA表達(dá)：通過(guò)GeneBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢miR-30a mRNA 基因編號(hào)并用primer 5.0 軟件及Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)的引物進(jìn)行合成，生成引物設(shè)計(jì)序列；抽提總RNA；采用Bio Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光采集圖片觀察條帶；測(cè)量總RNA濃度及純度，A260/280在1.8～2.0提示純度良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，A260/230>1表明胍類、酚類等殘留較少；U6設(shè)置為microRNA的內(nèi)參。qPCR反應(yīng)體系配制：預(yù)混液(2×)5 μL、正向引物(10 μmol/L)0.5 μL、反向引物(10 μmol/L)0.5 μL、DNA模板去核酸酶水1 μL、去RNA酶水加至10 μL，將qPCR反應(yīng)液移入96孔PCR反應(yīng)板中，加入獲得的cDNA模板，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，熔解曲線反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。

1.2.3 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)：加入細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制10% SDS-PAGE分離膠分離蛋白，電泳1.5 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用1×TBST洗膜1 min，加入5%脫脂牛奶封閉液，于搖床上常溫平緩搖動(dòng)2 h。倒掉封閉液，1×TBST洗膜5 min×3次，分別加入預(yù)先稀釋好的一抗、二抗(1∶1 000稀釋)，于搖床上孵育抗體。設(shè)置曝光參數(shù)，進(jìn)行圖片采集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組H9c2細(xì)胞中miR-30a mRNA的表達(dá)

與對(duì)照組相比，Ang2組和NE組miR-30a mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與NE組相比，Ang2組miR-30a mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖1)。

2.2 各組H9c2細(xì)胞中自噬蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比，NE組和Ang2組LC3、Beclin-1自噬蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.001)；與NE組相比，Ang2組LC3、 Beclin-1自噬蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.001)(圖2)。

2.3 miR-30a對(duì)Ang2引起的心肌細(xì)胞自噬的影響

使用末端由FAM熒光標(biāo)記的miR-30a mimics和miR-30a inhibitor轉(zhuǎn)染24 h后用熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，隨機(jī)選取心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染照片，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，其轉(zhuǎn)染率平均值>70%，說(shuō)明細(xì)胞被miR-30a mimics和miR-30a inhibitor有效轉(zhuǎn)染(圖3,4)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with NE group圖1 各組H9c2細(xì)胞miR-30a mRNA的表達(dá)水平Fig 1 Comparison of miR-30a mRNA expression in H9c2 cells of each

細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后使用Ang2刺激，Western blot檢測(cè)LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)。相比Ang2組，Ang2+miR-30a mimics組LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

Ang2與多種心血管疾病密切相關(guān)，心臟衰竭過(guò)程的Ang2過(guò)表達(dá)是心室重塑的重要影響因素。ACEI、ARB是以Ang2為作用靶點(diǎn)的藥物，能夠明確改善心室重塑、降低心血管疾病死亡率[8]，因此，深入探討Ang2與心血管疾病的內(nèi)在機(jī)制，對(duì)尋求有效的藥物治療靶點(diǎn)有重要意義，有研究表明Ang2可能通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。本研究在體外培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞，采用2×10-6mol/L 的Ang2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞自噬，設(shè)立去甲腎上腺素陽(yáng)性對(duì)照組，Western blot檢測(cè)自噬蛋白LC3、Beclin-1表達(dá)水平來(lái)判斷細(xì)胞自噬狀態(tài)，結(jié)果顯示特定濃度Ang2能夠引起心肌細(xì)胞自噬，本部分結(jié)果與Ang2相關(guān)的心肌細(xì)胞自噬結(jié)果一致，既往研究顯示心肌細(xì)胞過(guò)度自噬可能加重細(xì)胞肥大、纖維化等，是心臟衰竭發(fā)病過(guò)程中的重要機(jī)制，人參皂苷能通過(guò)AMPK/mTOR/PI3K途徑抑制Ang2引起的心肌細(xì)胞自噬[10]，單硝酸異山梨酯、白介素10也能夠抑制Ang2誘導(dǎo)的慢性心衰中的心肌細(xì)胞自噬過(guò)程[11]。

A.the protein expressions of LC3,Beclin-1 was detected by Western blot； B,C.the protein expression of LC3, Beclin-1 was compared in each groups; *P<0.001 compared with control group； #P<0.001 compared with NE group

圖3 miR-30a mimics轉(zhuǎn)染組圖片F(xiàn)ig 3 Images of miR-30a mimics transfection

圖4 miR-30a inhibitor轉(zhuǎn)染組圖片F(xiàn)ig 4 Images of miR-30a inhibitor transfection

A.the protein expressions of LC3,Beclin-1 was detected by Western blot; B,C.the protein expression of LC3, Beclin-1 was compared in each groups; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Ang2 group

有報(bào)道[12]表明Ang2處理新生大鼠心肌細(xì)胞48 h后細(xì)胞中LC3自噬蛋白明顯增加，且miR-30a參與細(xì)胞自噬過(guò)程[13]。本研究通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ang2組miR-30a 基因表達(dá)水平較正常組明顯下降，并進(jìn)一步猜測(cè)miR-30a可能參與了Ang2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。為了證實(shí)miR-30a能夠影響Ang2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬，使用miR-30a mimics、miR-30a inhibitor、miR-30a NC轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-30a能夠抑制Ang2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬。在此過(guò)程中，進(jìn)一步抑制miR-30a，未能進(jìn)一步增加心肌細(xì)胞自噬。既往研究[14-15]已證實(shí)miR-30a的靶基因是Beclin-1，可以靶向Beclin-1調(diào)控 LC3的表達(dá)，影響大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注誘導(dǎo)的自噬，從而影響心肌細(xì)胞的存活和凋亡。實(shí)驗(yàn)中Ang2已經(jīng)明確抑制了miR-30a表達(dá)，使用miR-30a inhibitor未能進(jìn)一步影響自噬。

綜上所述，本研究證實(shí)了Ang2能成功誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞自噬，在此過(guò)程中miR-30a表達(dá)降低，miR-30a mimics能夠抑制Ang2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。當(dāng)然，Ang2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬涉及多條通路、多個(gè)靶點(diǎn)，本研究只探討了miR-30a這一調(diào)控因子，因此完整的Ang2相關(guān)的自噬通路機(jī)制仍需進(jìn)一步探討；且miR-30a在Ang2誘導(dǎo)的心血管疾病中可能發(fā)揮重要作用，能夠成為新的潛在治療靶點(diǎn)。