鄭舒心，趙敏迪，邵 晨，孫海丹，劉曉燕，郭正光，孫 偉*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理系，北京 100005；2.北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學(xué)中心 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，北京 100730； 3.國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心 北京生命組學(xué)研究所，北京 102206)

近年來，尿液逐漸成為尋找疾病標(biāo)志物的重要來源[1]。但是，尿液生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的主要瓶頸之一是尿液蛋白的濃度和組成受到許多因素的影響，包括年齡、性別、飲食等[2]。因此，健康人尿蛋白質(zhì)組的個(gè)體差異分析可以排除疾病標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)過程中個(gè)體差異的影響，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供背景，具有重要的臨床價(jià)值[3]。

目前已有報(bào)道健康成人尿液中的個(gè)體差異蛋白，但以往分析多數(shù)是研究性別相關(guān)差異蛋白，且年齡相關(guān)差異蛋白研究深度不足[3-4]。本研究對正常人尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，試圖發(fā)現(xiàn)與年齡相關(guān)的尿蛋白，為后續(xù)的年齡相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)及疾病標(biāo)志物研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象:尿液樣本來自中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心。受試者為29名20～69歲的健康成年人。所有受試者都沒有急性或慢性疾病，在收集尿液時(shí)也沒有服用任何藥物。受試者年齡分組信息表1。所有受試者均簽署了知情同意書，本研究得到了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審批號：047-2019)。

表1 受試者年齡分組Table 1 Groups based on age of urine donors

1.1.2 試劑:二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAM)、尿素、硫脲(Sigma-Aldrich 公司)；胰蛋白酶(質(zhì)譜級)(Promega公司)；乙腈、甲酸、乙醇、碳酸氫銨均為色譜級(Merk公司)。

1.2 方法

1.2.1 尿蛋白提取及酶切：尿液樣本5 000×g/min 離心 30 min，去掉尿沉渣。上清液用 3 倍體積的乙醇在 4 ℃ 冰箱過夜后 10 000×g/min 離心 30 min 得到尿蛋白沉淀。沉淀用裂解液溶解[7 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲, 0.1 mol/L二硫蘇糖醇和50 mmol/L三氨基甲烷(Tris)]，37 ℃ 靜置 1 h，加入 1 mol/L 的碘乙酰胺至終濃度 0.05 mol/L，室溫避光 45 min。樣本轉(zhuǎn)移到 10 ku 超濾膜上用緩沖液 (7 mol/L 尿素和 50 mmol/L Tris)清洗兩次之后，用 25 mmol/L 碳酸氫銨溶液再清洗兩次。處理后的樣品在 25 mmol/L碳酸氫銨溶液中用胰蛋白酶消化。消化后的肽段從10 ku的過濾器中洗脫，在C18柱上脫鹽。

1.2.2 肽段預(yù)分離：29 個(gè)樣本及混合的質(zhì)控樣本肽段首先用高效液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，3 μm) 進(jìn)行預(yù)分離，多肽的洗脫液梯度為 5%～35% B 液(90% 乙腈)，流速為1 mL/min，洗脫時(shí)間為30 min。每分鐘收集一個(gè)組分，抽干后溶解于 0.1%甲酸水溶液，按照6～7、 8～9、 10～11、 12～13、 14～16、17～19、 20～22和 23～26 將收集的組分合并為 8 個(gè)組分。

1.2.3 質(zhì)譜分析：上述樣品的各個(gè)組分均采用相同的 LC-MS/MS 參數(shù)進(jìn)行分析。多肽樣品采用毛細(xì)管色譜柱(75 mm×100 mm) 進(jìn)行分離，多肽的洗脫液梯度為 5%～30% B 液(0.1% 甲酸，99.9%乙腈)，流速為300 nL/min，洗脫時(shí)間為 40 min。洗脫的肽段用TripleTOF 5600質(zhì)譜儀分析鑒定，分析模式采用數(shù)據(jù)依賴采集模式，參數(shù)如下: 一級全掃描分辨率為 40 000；二級掃描分辨率為20 000; 電荷篩選范圍(+2～+4); 二級全掃描范圍為100 m/z～1 800 m/z，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為15 s，掃描時(shí)間為100 ms。本實(shí)驗(yàn)總計(jì)共進(jìn)行了272 次LC-MS/MS質(zhì)譜分析，包括29個(gè)樣品的232次分析以及5次技術(shù)重復(fù)Q 樣品的40次分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.3.1 定性分析:質(zhì)譜數(shù)據(jù)應(yīng)用 Mascot (Matrix Science 公司，2.5.01版本)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，數(shù)據(jù)庫為 SwissProt 人類蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(www.uniprot.org, 20 121 條序列)。搜索參數(shù)為: 胰蛋白酶酶切，誤切位點(diǎn)為 2 個(gè)，母離子和子離子的質(zhì)量精確度為 5 ppm，固定修飾為半胱氨酸的脲基甲基化，可變修飾為甲硫氨酸氧化(+43.00 ku)。獲得的數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果由Scaffold進(jìn)一步處理(版本 4.0.7)蛋白水平的假陽性率為小于1%。

1.3.2 非標(biāo)記定量分析:應(yīng)用 Progenesis LC-MS軟件(版本 4.0)，將其電荷數(shù)篩選為 +2 到 +5 對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量分析。P<0.05且變化倍數(shù)大于 2 或小于 0.5 的蛋白為差異蛋白。

1.3.3 生物信息學(xué)分析:用 SIMCA 軟件(版本 14.1)對蛋白進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，用 IPA (Ingenuity Pathway Analysis)軟件對差異蛋白進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 尿液蛋白質(zhì)組的分析及年齡相關(guān)蛋白的篩選

在14名健康男性的尿液樣本中定量到1 683個(gè)蛋白質(zhì)，在15名健康女性的尿液樣本中定量到1 679個(gè)蛋白質(zhì)。通過計(jì)算5個(gè)QC重復(fù)中蛋白質(zhì)豐度的差異系數(shù)(CV)來評估該分析的技術(shù)差異，技術(shù)差異系數(shù)CV中位數(shù)為0.24。男性組與女性組中每種蛋白質(zhì)的生物差異分別用14名男性和15名女性尿樣中所測蛋白質(zhì)豐度來評估，男性組生物差異系數(shù)CV中位數(shù)為0.54，女性組生物差異系數(shù)CV中位數(shù)為0.55，都顯著高于技術(shù)變異系數(shù)中位數(shù)(0.24)。將兩組定量到的蛋白質(zhì)分別做PCA分析，結(jié)果表明男性組和女性組各自3個(gè)年齡段組之間的尿蛋白質(zhì)組表現(xiàn)出明顯的分離趨勢(圖1)。

對男性和女性組分別進(jìn)行年齡相關(guān)蛋白分析。根據(jù)P<0.05且蛋白表達(dá)顯著性差異倍數(shù)大于2倍為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白(圖2)。男性組和女性組與年齡相關(guān)的差異蛋白質(zhì)分別有100個(gè)和94個(gè)，共同的蛋白有12個(gè)，其中11個(gè)為上調(diào)蛋白，1個(gè)為下調(diào)蛋白(表2)。

2.2 年齡相關(guān)蛋白的生物信息學(xué)分析

男性組中上調(diào)的通路功能主要集中在維生素代謝、糖代謝及凝血系統(tǒng)；下調(diào)蛋白代謝通路功能主要集中在免疫系統(tǒng)、疾病以及肌醇磷酸代謝。女性組中上調(diào)蛋白的通路功能主要集中在維生素代謝、氨基酸代謝以及脂質(zhì)代謝；下調(diào)蛋白的通路功能主要集中在免疫系統(tǒng)以及疾病(圖3)。

3 討論

健康人尿液蛋白質(zhì)組的研究可以為疾病的診斷和監(jiān)測提供基礎(chǔ)。有研究表明隨著年齡的增長會(huì)導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，如心血管疾病[5]、關(guān)節(jié)炎[6]及癌[7]等。因此更深入的了解隨年齡增長相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的變化有助于衰老疾病機(jī)制的研究，并促進(jìn)新的抗衰老療法等研究的發(fā)展。

隨著年齡的增長，蛋白質(zhì)生物合成普遍減緩，與物質(zhì)營養(yǎng)代謝相關(guān)的許多酶的表達(dá)量降低，導(dǎo)致參與碳水化合物代謝、維生素代謝、能量代謝等過程中的化合物的生成明顯減少[8]。無論男性組或女性組中在青年組均發(fā)生上調(diào)的一個(gè)重要蛋白是亞甲基四氫葉酸脫氫酶 1 (C-1-tetrahydrofolate synthase，MTHFD1)，它是一種葉酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，是合成胸苷酸、嘌呤核苷酸和蛋氨酸的底物[9]。本研究中MTHFD1參與的代謝通路主要有葉酸多聚谷氨酸、組氨酸降解III及葉酸轉(zhuǎn)化I，說明隨年齡增長會(huì)發(fā)生氨基酸及葉酸代謝程度的降低。有實(shí)驗(yàn)表明MTHFD1在腎腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于健康人腎組織，同時(shí)MTHFD1表達(dá)增高的患者5年生存率明顯提高。這些結(jié)果證實(shí)了MTHFD 1對腎癌細(xì)胞的抗腫瘤作用[10]。年齡增長過程中MTHFD 1的表達(dá)量降低也許會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少和癌細(xì)胞增值加快而導(dǎo)致癌癥等疾病的發(fā)生，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖1 男性組女性組PCA分析Fig 1 PCA analysis of male and female groups

圖2 男性組和女性組差異尿蛋白火山圖分析Fig 2 Volcano analysis of differential proteins of male group (A, B) and female group (C, D)

表2 男性組和女性組共同的12個(gè)差異尿蛋白Table 2 Twelve differential urine proteins overlapped in male and female groups

圖3 男性組女性組差異表達(dá)蛋白代謝通路分析Fig 3 Pathway analysis of differential proteins of male group (A) and female group (B)

總之，本實(shí)驗(yàn)對男性女性不同年齡段健康成年人尿液應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來分析年齡相關(guān)的蛋白組特征。分析結(jié)果揭示了高齡人群與低齡人群的尿液蛋白質(zhì)組差別，這表明利用尿液蛋白質(zhì)組可以反映年齡相關(guān)的變化，有可能利用尿液發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)標(biāo)志物，并進(jìn)行年齡狀態(tài)的評估。