陳利娜，劉 志，張 超

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生化與分子生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510515； 2.南方醫(yī)院 超聲科，廣東 廣州 510000；3.湘南學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 郴州 423000)

放射治療(radiotherapy)常用于腫瘤治療，然而電離輻射在殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)也會(huì)損傷正常組織和細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性是提高腫瘤細(xì)胞殺傷效率和減少健康細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。電離輻射(ionizing radiation)是一種有效的DNA損傷因子，可導(dǎo)致細(xì)胞生物損傷[1]。眾多基因和通路可影響腫瘤放療效果，研究與DNA損傷密切相關(guān)的基因是尋找放療靶基因的方法之一。

秀麗隱桿線蟲(caenorhabditis elegans，C.elegans)有許多高度保守的與人類癌相關(guān)的基因和通路，且對(duì)電離輻射表現(xiàn)出較高的敏感性，是一種理想的電離輻射研究模型[2]。本研究采用X線照射秀麗隱桿線蟲，檢測(cè)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)，以及線蟲死亡率、生育力變化，探討輻射損傷修復(fù)的分子機(jī)制，為尋找放療潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型秀麗隱桿線蟲N2、大腸桿菌OP50(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)予)；NGM培養(yǎng)基、M9緩沖液按照參考文獻(xiàn)[3]配制而成，RNAiso Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR?PCR試劑盒(TaKaRa公司)；PCR引物(廣州嘉吉生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)及計(jì)數(shù)：取50條產(chǎn)卵期秀麗隱桿線蟲接種至培養(yǎng)有大腸桿菌菌株OP50的NGM瓊脂平板，于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h，挑走母蟲后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。線蟲計(jì)數(shù)采用稀釋法：M9緩沖液沖洗收集培養(yǎng)皿中線蟲至離心管，稀釋50倍，62 ℃水浴1 min后混勻，取1 mL線蟲懸液至畫好方格的35 mm的培養(yǎng)皿，在體式顯微鏡下放大100倍對(duì)線蟲計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取平均值,再乘以稀釋倍數(shù)即為線蟲總數(shù)。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的電離輻射：線蟲計(jì)數(shù)后將線蟲懸液離心使線蟲沉淀，棄去上清，加入相應(yīng)體積的M9緩沖液，使得線蟲懸液的濃度為5 000條/200 μL。在含有OP50的NGM培養(yǎng)基中加入5 000條線蟲(200 μL)，培養(yǎng)48 h后成蟲繁殖到約80 000條時(shí)進(jìn)行輻射。使用日立MBR-1520R型X線輻射裝置(Hitachi Co., LTD)調(diào)節(jié)輻射強(qiáng)度為20 Gy/min，并增加濾片使照射場(chǎng)強(qiáng)均一。輻照時(shí)敞口垂直于束流方向放置，置于正對(duì)著束流方向的培養(yǎng)基表面分別照射10 min和20 min，累計(jì)輻射劑量分別為200 Gy和400 Gy。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)：RNAiso Plus試劑提取線蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將合格的總RNA反向轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。使用SYBR?PCR試劑盒在ABI公司7500型實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR。內(nèi)部參照基因采用gpd-1。用于PCR的基因和引物見表1。2-ΔΔCt值反映基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.4 秀麗隱桿線蟲死亡率和繁殖力的檢測(cè)：線蟲經(jīng)200 Gy X線照射后2 h內(nèi)取約5 000條線蟲(200 μL)轉(zhuǎn)移至加有400 μmol/L 5-氟脫氧尿苷(FUDR)的NGM培養(yǎng)基，以抑制卵的孵出。繼續(xù)培養(yǎng)2 d后對(duì)活線蟲計(jì)數(shù)。線蟲死亡率計(jì)算公式如下：[Δ存活數(shù)/存活數(shù)(輻射前)]×100。線蟲經(jīng)200 Gy X線照射后2 h內(nèi)取約5 000條線蟲(200 μL)轉(zhuǎn)移至新NGM培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后對(duì)活的子代幼蟲計(jì)數(shù)，反映線蟲的繁殖力。線蟲計(jì)數(shù)時(shí)，于體式顯微鏡下觀察其形態(tài)和運(yùn)動(dòng)情況，呈正弦曲線樣運(yùn)動(dòng)的線蟲為活線蟲；喪失運(yùn)動(dòng)能力, 咽泵停止運(yùn)動(dòng),多次碰觸無反應(yīng)的線蟲為死亡的線蟲。

1.2.5 輻射相關(guān)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析：將輻射后表達(dá)差異基因?qū)氲鞍踪|(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫STRING (https://string-db.org/)，并選擇種類為C.elegans，分析各基因編碼蛋白之間的相互作用及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 X線影響秀麗隱桿線蟲多個(gè)基因的表達(dá)

X線照射后12個(gè)基因(ced-3、ced-4、ced-9、egl-1、cep-1、rad-51、age-1、daf-2、daf-16、ctl-1、clk-1和spe-26)表達(dá)量增加，2個(gè)基因(mev-1、hsp-12.2)表達(dá)量減少。多組比較結(jié)果顯示，400 Gy組中有8個(gè)基因(ced-3、ced-4、ced-9、rad-51、age-1、daf-2、ctl-1、spe-26)的表達(dá)明顯高于200 Gy組。實(shí)驗(yàn)組的4個(gè)基因(ced-4、cep-1、rad-51、daf-2)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。200 Gy組基因mRNA表達(dá)量的倍數(shù)變化如下：ced-4(2.861±0.243)、cep-1(5.540±1.889)、rad-51(5.530±0.647)、daf-2(4.453±0.686)。400 Gy組數(shù)據(jù)如下：ced-4(9.644±1.022)、cep-1(10.140±1.150)、rad-51(19.017±2.627)、daf-2(8.948±0.907)(圖1)。

2.2 X線導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲死亡率增加、繁殖力下降

與對(duì)照組相比，200 Gy組的線蟲存活率明顯下降。200 Gy X線導(dǎo)致線蟲77.23%死亡率(圖2A)。對(duì)照組培養(yǎng)2 d后平均產(chǎn)生線蟲后代數(shù)是200 Gy組的2.90倍(圖2B)。

2.3 秀麗隱桿線蟲輻射相關(guān)基因的相互作用

12個(gè)基因之間具有相互作用，并顯著分為兩組作用密切的基因群。其中，age-1、daf-16和ced-9分別為兩組基因的中心節(jié)點(diǎn)。daf-16和cep-1為兩組基因的關(guān)聯(lián)基因(圖3)。

3 討論

電離輻射可促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和DNA修復(fù)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在真核細(xì)胞中產(chǎn)生特定生物效應(yīng)所需的電離輻射劑量與細(xì)胞基因組含有基因數(shù)的多少成反比，秀麗隱桿線蟲模型用于研究電離輻射特性時(shí)所需的劑量遠(yuǎn)大于哺乳動(dòng)物[4]。本研究中X線輻射線蟲的半致死劑量為200 Gy[5]，故輻射劑量定為200 Gy和400 Gy。

Expression levels, relative to gpd-1( a type of housekeeping gene ), were determined by quantitative real time RT-PCR; *P<0.05，**P<0.01 compared with controls

A.mortality； B.fertility；*P<0.05 compared with controls圖2 X線對(duì)秀麗隱桿線蟲的影響Fig 2 Effect of X-ray on n=6)

圖3 輻射相關(guān)基因的蛋白相互作用圖Fig 3 Protein interaction of radiation related genes

egl-1可使ced-9失活，從而拮抗apaf-1同源基因ced-4激活caspase同源基因ced-3的能力。此外，p53同源基因cep-1可以激活egl-1和ced-13的轉(zhuǎn)錄。因此，cep1、egl-1、ced-3、ced-4和ced-9等基因的相互作用形成了調(diào)控秀麗線蟲程序性細(xì)胞死亡和DNA損傷誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞死亡的核心凋亡通路[6-8]。本研究中，線蟲輻射后存活數(shù)減少，凋亡相關(guān)基因ced-3、ced-4、cep-1表達(dá)量顯著增加，且隨輻射劑量增加而大幅度增加。基因相互作用分析結(jié)果顯示，cep-1、ced-4、rad-51關(guān)聯(lián)密切。提示這3個(gè)基因?qū)﹄婋x輻射敏感度高，可能是X線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心基因。

進(jìn)化生物學(xué)表明，繁殖需要付出降低壽命的成本，線蟲延長(zhǎng)壽命基因的改變會(huì)導(dǎo)致生育能力下降[9-10]。mev-1突變體使秀麗隱桿線蟲平均壽命縮短30%，age-1、clk-1和spe-26、hsp-12.2的突變體，可改變秀麗隱桿線蟲的年齡特異性死亡率和生育率[11-12]，胰島素信號(hào)通路可提高秀麗隱桿線蟲的繁殖力[13]。daf-2是一種類似于胰島素受體的基因，調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲的壽命和滯育。daf-16可加強(qiáng)線蟲生殖細(xì)胞損傷的適應(yīng)。daf-2和daf-16都是胰島素信號(hào)通路的重要成員，對(duì)秀麗隱桿線蟲的繁殖力起關(guān)鍵作用[14]。本研究中，經(jīng)輻射處理后的線蟲成活率較低，經(jīng)過2 d培養(yǎng)后產(chǎn)生線蟲的后代總數(shù)較少，說明200 Gy X線導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲的死亡率較高，生育力較低。結(jié)合輻射后線蟲基因表達(dá)的變化，推測(cè)X線致使daf-2和daf-16異常高表達(dá)，從而抑制胰島素信號(hào)通路，降低線蟲生殖質(zhì)量，抑制線蟲繁殖。X線可顯著提高線蟲daf-2、age-1、clk-1、spe-26的表達(dá)，從而改變線蟲的死亡率和生育能力。

綜上所述，X線可影響秀麗隱桿線蟲多個(gè)DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)，并導(dǎo)致線蟲死亡率增加、繁殖力下降。age-1、cep-1、ced-4、rad-51和daf-2等基因?qū)線敏感，可能成為潛在的放療靶點(diǎn)。