任海燕，王永康，趙愛玲，薛曉芳，李 毅，李登科

（山西農(nóng)業(yè)大學果樹研究所，果樹種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點實驗室，太谷 030815）

棗落花落果嚴重，坐果率低，一般自然坐果率僅1%左右[1]，且棗胚敗育普遍存在[2]。許多學者針對這一現(xiàn)象，開展了棗柱頭可授性、花粉萌發(fā)情況、授粉受精等開花生物學特性的研究，國內(nèi)研究較多的使用聯(lián)苯胺-過氧化氫法（MTT）測定柱頭的可授性[3-6]，此方法雖快捷，但可授性強弱指標難以量化。相比而言，利用熒光顯微法判斷柱頭可授性和花粉管生長較為直觀準確[7-11]。棗花柱微木質(zhì)化，花柱細胞組織較厚，在熒光顯微觀察時易出現(xiàn)花粉管生長過程被花柱組織遮擋的現(xiàn)象，因此在試驗過程中，常采用適宜濃度的NaOH作為軟化劑軟化花柱，可以達到預期的效果。但若NaOH濃度使用不當，或出現(xiàn)花柱壓片不成形，或花粉管結(jié)構(gòu)不清晰等影響試驗效果。為了提高棗花粉管生長特性等相關試驗的效率，以期得到理想的試驗圖片，本研究以‘冷白玉’棗花為試材，對軟化方法、染色pH環(huán)境進行了優(yōu)化，以期為棗花粉管生長特性的研究提供實驗方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料‘冷白玉’棗采自山西省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所國家棗資源圃，該品種盛花期為6月上旬，選取無病、長勢良好的棗吊，定花定果，以黃蕾期（蜜盤剛出蜜）進行人工授粉，授粉品種為‘伏脆蜜’，花粉萌發(fā)率為94%。

1.2 試驗方法

1.2.1材料

采集棗花，置于FAA（70%乙醇∶甲醛∶冰醋酸=90∶5∶5）固定液中固定備用。

1.2.2不同軟化處理的優(yōu)化

從FAA中取出棗花，蒸餾水清洗10次，分別置于不同的條件進行軟化：于8 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min；于2 mol/L NaOH溶液中浸泡并文火水煮30 min；于8 mol/L NaOH溶液中浸泡并在60 ℃恒溫水浴中10 min。每處理重復3次，每次選取棗花30朵。

1.2.3不同pH值緩沖液處理的優(yōu)化

棗花經(jīng)過2 mol/L NaOH溶液浸泡并文火水煮30 min軟化后，經(jīng)不同pH值梯度緩沖液（1 mol/L NaOH與45%冰醋酸配制而成），pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0，浸泡50 min。每處理重復3次，每次選取棗花30朵。

1.2.4不同染色劑處理的優(yōu)化

棗花經(jīng)過2 mol/L NaOH溶液浸泡并文火水煮30 min軟化后清洗2～3次，經(jīng)緩沖液pH值為7.0浸泡50 min清洗后，置于不同的染色劑：0.1%水溶性苯胺藍，染色30 min；0.1 g水溶性苯胺藍+0.7 g K3PO4，蒸餾水定容至100 mL，加45%冰乙酸調(diào)至pH值為8.0，染色5 min。每處理重復3次，每次選取棗花30朵。

棗花染色后，蒸餾水清洗4～5次后，用刀片和鑷子取出雌蕊，放置在載玻片上，輕蓋蓋玻片，制片后在倒置熒光顯微鏡（Olympus DP71）下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaOH溶液處理對棗花雌蕊軟化效果的影響

如圖版2所示，棗花在8 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min，花柱表面的花粉粒不清晰，花柱成形（圖版2-A-a）；棗花在2 mol/L NaOH溶液中浸泡并水煮30 min后，花粉管形態(tài)清晰可見，且花柱結(jié)構(gòu)基本保持完整（圖版2-A-b）；在8 mol/L NaOH溶液中浸泡并在60 ℃恒溫水浴中10 min，花柱表面的花粉粒可以看到，但花柱不成形、破裂，花粉管暴露，不能觀察到完整的花柱結(jié)構(gòu)（圖版2-A-c）。通過比較，棗花在2 mol/L NaOH溶液中浸泡并水煮30 min，軟化效果好，花柱結(jié)構(gòu)保持完整且花粉管清晰可見。

2.2 不同pH值緩沖液處理對花粉管染色效果的影響

當緩沖液pH值為3.0時，花柱細胞呈藍色，花粉管染色與其他部分對比不明顯（圖版2-B-a）；當pH值為5.0時，花柱細胞部分呈藍色，可觀察到少量的花粉（圖版2-B-b）；當pH值為7.0時，可清晰可見花粉管在花柱道中的伸長情況，花柱呈透明狀，拍攝效果最佳（圖版2-B-c）；當pH值為9.0時，花柱細胞呈黑色，可觀察到部分花粉粒，花柱與背景對比差，無法觀察到花粉管的伸長情況（圖版2-B-d）。由此可見，當緩沖液pH值為7.0時，觀察花粉萌發(fā)及花粉管伸長情況，效果最佳。

2.3 不同染色劑處理對棗花粉管染色效果的影響

棗花經(jīng)緩沖液浸泡，蒸餾水清洗后在0.1%水溶性苯胺藍條件下，染液呈酸性，亮藍色，滴于白紙上有藍色染暈，染色30 min，觀察可見花柱表面花粉粒情況及花粉在柱頭萌發(fā)情況，但在花柱道中只可觀察到部分花粉管萌發(fā)，染色不明顯（圖版2-C-a）；在加有K3PO4的苯胺藍染液，pH值為8.0的條件下，染液呈暗藍色、清亮，滴于白紙上無染暈，染色5 min，染色效果好，可清晰觀察到花粉管萌發(fā)情況，花粉管結(jié)構(gòu)明顯（圖版2-C-b）。研究結(jié)果表明，在加有0.7 g K3PO4的0.1%水溶性苯胺藍溶液中花粉管清晰可見，染色效果好。

3 結(jié)論與討論

NaOH溶液的強堿性能可以很好地降解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等成分[12-14]，從而達到軟化材料的效果。許多研究者利用NaOH軟化這一原理觀察花粉管生長特性，但不同樹種所使用的NaOH濃度不同[15-17]。在棗方面，也有不少研究。王堯等[7]、張學英等[8]、李登科等[10]研究棗花粉萌發(fā)情況和授粉受精過程均使用8 mol/L NaOH進行解離軟化花柱。邵鳳俠等[9]在對‘中秋酥脆棗’柱頭形態(tài)發(fā)育進程與可授性研究中，使用的軟化劑為10 mol/L NaOH軟化10 h。本試驗改變了以往使用NaOH浸泡的方式，而是使用2 mol/L NaOH，并進行水煮的方式，使花柱組織得到了最大程度的透明化處理，這一結(jié)果在侯思皓等[11]研究棗花粉生長特性中也同樣得到了證實。

本試驗比較了3種軟化棗花的方法，認為經(jīng)FAA固定的棗花，蒸餾水清洗5～6次后，浸泡在2 mol/L NaOH溶液中，文火水煮30 min，取出棗花蒸餾水清洗5～6次，在pH值為7.0的緩沖液中浸泡50 min，取出棗花清洗5～6次，然后進行染色的方法，無需將棗花從FAA中取出進行酒精梯度復水，簡化了軟化步驟，避免了棗花柱結(jié)構(gòu)的破裂，使花柱組織得到了最大程度的透明化處理，花粉管觀察效果更佳，大大地提高了實驗效率。

苯胺藍壓片觀察花粉萌發(fā)在很多植物上應用廣泛，該方法簡便、快捷、直觀，其原理是苯胺藍在堿性條件下與花粉管壁中的胼胝質(zhì)發(fā)生反應，在紫外光下發(fā)出黃綠色熒光[17]。苯胺藍染液在過酸或過堿環(huán)境中，染色效果均差。本研究結(jié)果證實了苯胺藍染液在pH值為8.0，染液呈暗藍色、清亮，滴于白紙上無染暈。棗花無需在苯胺藍染液中過夜染色，只需在pH值為8.0的苯胺藍染液染色5 min，即可制片后觀察，花粉管清晰，且與花柱細胞對比明顯，染色效果最佳?？梢姡啾葌鹘y(tǒng)方法，圖片效果明顯改善，染液pH值的確定可提高實驗的效率和準確性。

傳統(tǒng)方法聯(lián)苯胺-過氧化氫法是將柱頭浸于苯胺藍-過氧化氫反應液中，通過觀察柱頭周圍是否呈現(xiàn)藍色并有大量氣泡來判斷柱頭是否具有可授性。首先，這種方法需通過觀察柱頭染色顏色的深淺來判斷柱頭可授性的強弱，觀察結(jié)果無法標準量化。其次，此方法反應時間不一致，一般對于可授性弱的棗柱頭，反應時間需10～15 min；而對于可授性強的柱頭，反應時間也需3～5 min，才能觀察到結(jié)果[4-5]。相比而言，通過熒光顯微鏡能夠直觀地觀察到花粉管生長的真實情況，能夠清晰、準確地反映出授粉后各部分的動態(tài)變化[18]。本文介紹的方法進一步優(yōu)化了棗柱頭熒光染色方法，主要體現(xiàn)在以下幾方面。①簡化了處理過程：將棗花從FAA液中取出后無需進行酒精梯度復水。②花柱結(jié)構(gòu)保持完整，花粉管更為清晰：軟化處理只需浸泡在2 mol/L NaOH的溶液中，文火水煮30 min即可，無需在NaOH溶液中浸泡數(shù)小時，避免了較厚的棗花柱組織遮擋花粉管的現(xiàn)象。③節(jié)省了時間，更加高效：棗花在pH值為8.0的苯胺藍染液染色5 min即可制片后觀察，無需在苯胺藍染液中過夜染色，節(jié)省了時間。此外，染液pH值的確定大大地提高了實驗的效率和準確性。