馬楚彬，農(nóng)曉琳，陳 怡，梁 晨

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，南寧 530021）

糖尿病(DM)是一種代謝紊亂疾病，它通過(guò)一定的機(jī)制直接或間接影響大腦和行為反應(yīng)。許多證據(jù)表明，DM 患者面臨嚴(yán)重的腦并發(fā)癥[1]。近年來(lái)，牙周炎與DM的關(guān)系也受到極大關(guān)注。在臨床實(shí)踐中，DM 患者的血糖控制不良會(huì)使患牙周炎的可能性增加，已有牙周炎的甚至能加快其進(jìn)展速度[2-3]。DM 患者常同時(shí)存在較嚴(yán)重的牙周病，它會(huì)引起慢性炎癥反應(yīng)，可能對(duì)血糖控制產(chǎn)生不良影響[4]。長(zhǎng)期慢性高血糖改變了血腦屏障的功能和結(jié)構(gòu)，使血管通透性增加，神經(jīng)毒性基質(zhì)進(jìn)入大腦，影響神經(jīng)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞變性、凋亡導(dǎo)致的神經(jīng)元數(shù)目減少是造成認(rèn)知功能障礙的病理基礎(chǔ)[5]。細(xì)胞凋亡不僅影響正常發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)，在各種急慢性神經(jīng)退行性疾病的病程進(jìn)展中也起重要作用。而在牙周病人牙齦組織破壞的炎癥進(jìn)程中，凋亡相關(guān)因子的表達(dá)量有所增加[6-7]。因此，如何有效控制DM和牙周炎的進(jìn)程，進(jìn)而控制血糖，預(yù)防腦并發(fā)癥的發(fā)生或改善其病理進(jìn)展是尚待解決的重要難題。

青蒿琥酯（artesunate，ART）為青蒿素的衍生物，有抑制炎癥因子形成的功效[8]。此外，ART還有抗腫瘤的作用，并且由于其良好的耐受性，ART 常用于與其他藥物進(jìn)行的混合配置[9-10]。作為治療腦型瘧疾最有效的藥物，近期的研究發(fā)現(xiàn)，ART 在治療腦型瘧疾的過(guò)程中還能緩解腦的炎癥狀態(tài)[11-12]。ART 能夠透過(guò)血腦屏障到達(dá)腦內(nèi)并且維持較高的濃度，這個(gè)特性使它能夠成為一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)功能紊亂的備選藥物[13]。有研究團(tuán)隊(duì)對(duì)外傷性腦損傷進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)ART 具有抗凋亡作用，從而證實(shí)ART具有一定的保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[14]。同時(shí)ART 對(duì)1 型DM 還具有一定的預(yù)防作用[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了1型DM和牙周病大鼠模型，并以不同濃度的ART進(jìn)行藥物干預(yù)。處死大鼠取材后通過(guò)蘇木精－伊紅（HE）染色來(lái)觀察腦組織病理改變，使用免疫組化染色分析腦組織相應(yīng)部位腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白的表達(dá)情況，探究ART不同的干預(yù)濃度對(duì)腦組織病變的影響，為臨床中口腔－全身疾病的預(yù)防及治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物 選擇SPF級(jí)SD大鼠，雄性，6 周齡，約200 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠在SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室中使用亞籠飼養(yǎng)，在20～25 ℃的環(huán)境溫度下自由進(jìn)食和飲水。鏈脲佐菌素（STZ）與戊巴比妥鈉購(gòu)于美國(guó)sigma 公司，ART 購(gòu)買(mǎi)于桂林南藥股份有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字H10930195）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 試驗(yàn)性喂養(yǎng)1周后，將48只大鼠隨機(jī)分為6組，即對(duì)照組、1 型DM組（DM）、伴牙周病1 型DM組（DM&PD）、ART低劑量干預(yù)組（DM&PD ART 10 mg/kg）、ART中劑量干預(yù)組（DM&PD ART 30 mg/kg）、ART高劑量干預(yù)組（DM&PD ART 60 mg/kg），每組8只。確認(rèn)成模后，各干預(yù)組每日分別予ART 10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg灌胃治療，持續(xù)4周。

1.3 構(gòu)建模型 大鼠腹腔注射1%STZ(60 mg/kg)構(gòu)建1 型DM 模型。注射后第3、第7、第14 天尾尖采血測(cè)空腹血糖值，若均高于16.7 mmol/L，則確認(rèn)建模成功。使用正畸結(jié)扎絲結(jié)扎上頜磨牙頸部，同時(shí)在齦溝內(nèi)涂布牙齦卟啉單胞菌菌液來(lái)構(gòu)建牙周病模型。之后觀察牙周情況，若出現(xiàn)牙齦出血紅腫、牙槽骨吸收、附著喪失等相關(guān)牙周病病征即可確認(rèn)牙周病造模成功。

1.4 終末血糖測(cè)定 用藥4周后，尾尖針刺后用羅氏試紙采血，使用快速血糖儀（羅氏活力型，德國(guó)）測(cè)大鼠空腹血糖值。之后使用過(guò)量戊巴比妥鈉溶液麻醉處死大鼠。

1.5 制作石蠟切片組織固定液（4%多聚甲醛）固定大鼠腦組織，24 h 后，沿矢狀面切成厚度約2 mm的薄片，采用二甲苯以及75%、85%、95%、無(wú)水酒精進(jìn)行梯度脫水，浸蠟后在包埋機(jī)上進(jìn)行包埋。包埋好的蠟塊-20 ℃冷凍2 h 后在切片機(jī)上進(jìn)行連續(xù)切片。恒溫箱中60 ℃烤片4 h后裝盒備用。

1.6 HE染色觀察腦組織病理學(xué)改變（1）脫蠟、復(fù)水：將切片放入二甲苯、二甲苯、二甲苯、無(wú)水乙醇、95%酒精、85%酒精、75%酒精各5 min，蒸餾水洗3 次。（2）蘇木精染細(xì)胞核：將切片放入新配的蘇木精染液中1 min，掛缸30 s，蒸餾水洗3次，1%鹽酸酒精分化10 s，蒸餾水洗3次，返藍(lán)10 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞核均藍(lán)染著色后，行下一步。（3）伊紅染細(xì)胞質(zhì)：將切片置入伊紅染液中5 s，后蒸餾水洗3 次。（4）脫水封片：將染好后的切片置烤片機(jī)上充分烤干，中性樹(shù)膠封片。（5）顯微鏡觀察，采集圖像并分析。

1.7 免疫組化染色觀察TNF-ɑ、Caspase-3表達(dá)情況 取切片按上述脫蠟復(fù)水步驟操作后，用枸櫞酸溶液（pH=6.0）浸沒(méi)，置于高壓鍋內(nèi)高壓修復(fù)5 min，取出后自然冷卻至室溫，去離子水洗3次。后用3%過(guò)氧化氫溶液浸泡10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗3 次。后將切片在山羊血清中封閉10 min，甩去血清后加一抗TNF-α、Caspase-3（稀釋倍數(shù)1∶250）置于4 ℃冰箱過(guò)夜。第二天取出切片回復(fù)至室溫，PBS 洗3 次后滴加二抗并37 ℃孵育10 min。PBS 洗3 次后滴加辣根素（SAB）置于37 ℃孵育10 min。PBS 洗3 次后滴加DAB 顯色液，約3 min 流水輕柔沖洗，蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察到細(xì)胞核著色后用1%鹽酸酒精分化10 s，染色即完成。按上述步驟干燥并封片。之后使用Nikon正置熒光顯微鏡拍攝腦組織切片相應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域。400 倍率觀察并采集圖像。采用Image pro plus6.0軟件分析計(jì)算圖像中相應(yīng)部位TNFɑ、Caspase-3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值(mean optical density,MOD)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的終末血糖值比較 與對(duì)照組比較，DM組與DM&PD組大鼠的終末血糖值顯著較高，且DM&PD組升高更明顯（P＜0.01）。各干預(yù)組血糖值有不同程度的下降（P＜0.01），其中DM&PD ART 60 mg/kg組下降較為明顯，DM&PD ART 10 mg/kg組、DM&PD ART 30 mg/kg組較為接近，見(jiàn)圖1。

2.2 腦組織HE染色結(jié)果 在對(duì)照組大鼠腦組織皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)中，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，層次清楚。DM組大鼠皮層出現(xiàn)核固縮和核深染的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，DM&PD組更明顯。3個(gè)不同ART濃度的治療組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)均有不同程度的改善，神經(jīng)元核固縮和核深染的數(shù)量明顯降低（圖2a）。不同組別核固縮和核深染的神經(jīng)元的占比（異常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量/視野下的總細(xì)胞數(shù)量）結(jié)果（圖2b）。DM組與DM&PD組異常神經(jīng)元占比明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），DM組比DM&PD組低（P＜0.05）。各ART干預(yù)組異常神經(jīng)元占比明顯低于DM&PD組（P＜0.01），ART 30 mg/kg組和ART 60 mg/kg組低于ART 10 mg/kg組（P＜0.01），說(shuō)明ART 干預(yù)可能減輕神經(jīng)元退行性變，且與濃度有關(guān)。

2.3 腦組織TNF-α，Caspase-3免疫組化染色結(jié)果

各組大鼠腦組織皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和胞膜中均見(jiàn)有TNF-α、Caspase-3的棕黃色顆粒表達(dá)（圖2a）。各組間相互比較可發(fā)現(xiàn)（圖2c,2d），DM組及DM&PD組TNF-α、Caspase-3 的表達(dá)明顯要高于對(duì)照組，且DM&PD組TNF-α、Caspase-3 的表達(dá)高于DM組（均P＜0.01）。不同ART 劑量的干預(yù)組TNF-α、Caspase-3 的表達(dá)明顯低于DM&PD組。TNF-α 的表達(dá)量 在DM&PD ART 10 mg/kg組 與DM&PD ART 30 mg/kg組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,而DM&PD ART 60 mg/kg組的表達(dá)量明顯低于DM&PD ART 10 mg/kg組與DM&PD ART 30 mg/kg組（P＜0.01）。Caspase-3的表達(dá)量在DM&PD ART 10 mg/kg組與DM&PD ART 30 mg/kg組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而DM&PD ART 60 mg/kg組的表達(dá)量明顯低于DM&PD ART 10 mg/kg組與DM&PD ART 30 mg/kg組（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠終末血糖值比較

3 討論

在牙周病的影響下，DM 引起的腦組織病變會(huì)朝更嚴(yán)重的方向發(fā)展，這是一個(gè)多因素互相影響的過(guò)程，最終常常導(dǎo)致患者認(rèn)知功能弱化，嚴(yán)重的甚至生活難以自理。因此，對(duì)于伴牙周病的DM 腦組織病變相關(guān)機(jī)制的研究有重要的意義。本研究通過(guò)注射STZ 并對(duì)大鼠磨牙區(qū)進(jìn)行結(jié)扎涂菌來(lái)構(gòu)建伴牙周病I型DM模型，參考了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的常用方法[16-17]。成模效果良好，模型組的大鼠可見(jiàn)明顯的DM及牙周炎癥表現(xiàn)，可見(jiàn)其多飲多食多尿，體重反而下降，伴有牙齦出血、牙周附著喪失、牙周溢膿、牙槽骨有一定程度的吸收。課題組前期實(shí)驗(yàn)已嘗試使用50 mg/kg ART 和100 mg/kg ART 灌胃干預(yù)，發(fā)現(xiàn)100 mg/kg ART干預(yù)降糖效果較好，但與50mg/kg ART相比并無(wú)太大差別。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，過(guò)高濃度的ART干預(yù)對(duì)大鼠的肝腎代謝有一定毒副作用，故嘗試本實(shí)驗(yàn)中所采用的3種ART干預(yù)濃度來(lái)探究較為合理的劑量。

通過(guò)HE 染色的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠大腦皮層中的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，層次清楚。DM組大鼠皮層出現(xiàn)核固縮和核深染的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，且細(xì)胞間隙增大，數(shù)量減少，體積縮小。這在DM&PD組更為明顯。而在3個(gè)不同ART濃度的治療組中可觀察到神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)有不同程度的改善。為了進(jìn)一步研究，筆者對(duì)大鼠大腦皮層中的TNF-ɑ、Caspase-3 表達(dá)量進(jìn)行了分析。

在牙周病及DM 進(jìn)展的過(guò)程中，TNF-ɑ 是一個(gè)重要的起促炎作用的因子。TNF-α是一種從具有免疫活性的細(xì)胞釋放的具有促炎作用的可溶性遞質(zhì)。它能促進(jìn)前列腺素合成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，激活破骨細(xì)胞功能，促進(jìn)骨吸收。TNF-α 的各項(xiàng)作用表明它在介導(dǎo)由感染或其他損害導(dǎo)致的免疫炎癥反應(yīng)的過(guò)程中扮演重要的角色[18]。在牙周病患者中能檢測(cè)到高濃度的TNF-α，說(shuō)明其對(duì)牙周病程的進(jìn)展有重要作用。同時(shí)，又有研究報(bào)道，DM患者增長(zhǎng)的TNF-α激活了各種應(yīng)激酶，使胰島素底物受體（IRS-1）磷酸化，進(jìn)而擾亂胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[19-21]。胰島素信號(hào)通路對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞行使正常的功能有重要的作用，因而炎癥介導(dǎo)的信號(hào)通路的改變會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能的缺陷[22-24]。

研究證實(shí)，DM患者若伴有牙周病，他們的血糖會(huì)更難控制[25-27]。在本實(shí)驗(yàn)中，從腦組織皮層中測(cè)得的TNF-ɑ 表達(dá)量可以發(fā)現(xiàn)，DM&PD組明顯高于DM組（P＜0.01），可見(jiàn)牙周病確實(shí)在一定程度上加大了DM引起的腦組織炎癥的嚴(yán)重程度。3個(gè)治療組ART的濃度逐漸提高，TNF-ɑ的表達(dá)量逐漸降低（P＜0.01），說(shuō)明ART 可能緩解了腦組織的炎癥狀態(tài)，且濃度越高效果越好。

近年來(lái)，關(guān)于DM 引起的腦并發(fā)癥的研究較熱門(mén)，許多學(xué)者將DM與阿爾茨海默?。ˋD）聯(lián)系在一起，將其列為AD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。最近對(duì)AD病程的研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase-3 裂解了細(xì)胞中的早老素（與早期發(fā)病的家族性AD 有關(guān)）?；诖耍环N假說(shuō)認(rèn)為Caspase-3介導(dǎo)的相關(guān)蛋白的裂解可能促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生并最終導(dǎo)致神經(jīng)元非正常的凋亡[28]。有實(shí)驗(yàn)提出，這一行為可能促進(jìn)Aβ蛋白的病理性增長(zhǎng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，使神經(jīng)元發(fā)生退行性變化，最終導(dǎo)致認(rèn)知障礙的發(fā)生[29-31]，但具體機(jī)制仍待探究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化確實(shí)能觀察到Caspase-3 在DM&PD組的表達(dá)量明顯高于DM組（P＜0.01），當(dāng)ART干預(yù)的濃度較高時(shí)，Caspase-3 的表達(dá)量更低（P＜0.01）。說(shuō)明ART也許通過(guò)控制Caspase-3 的表達(dá)來(lái)緩解腦組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建1 型DM 和牙周病模型，探究了伴牙周病1 型DM 大鼠腦組織炎癥相關(guān)機(jī)制及神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平，并采用不同濃度的ATR 進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其能有效降低腦組織炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減少其凋亡。分析得出較高濃度的ART對(duì)伴牙周病1型DM引起的腦組織病變有一定的防治作用。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，伴DM牙周炎大鼠腸道上皮有所損傷，通透性改變，會(huì)造成腸道菌群組成變化。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腦－腸－菌群間存在相互作用，腸道菌群改變會(huì)影響腦穩(wěn)態(tài)，使得患者進(jìn)食的回饋機(jī)制和抑制機(jī)制出現(xiàn)問(wèn)題，可能進(jìn)一步加重DM進(jìn)展。之后的研究可朝此方向深度探究。同時(shí)，本研究對(duì)于炎癥和凋亡相關(guān)通路的探索比較局限，尚待進(jìn)一步的深入探究。