徐 濤 ，劉 暢，李曉瑩，陳 芳，葛盈盈,3，薛春紅，李 鑫，張慶梅,3，謝小薰,3，羅 彬,3△

（廣西醫(yī)科大學 1.基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室；3.基礎醫(yī)學院基礎醫(yī)學中心實驗室，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經外科，南寧 530021）

原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其90%以上為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）[1-2]。目前，手術切除、放療和化療是治療HCC 的主要手段，由于術后殘余病灶復發(fā)、放化療抵抗，患者預后效果依舊不理想[3-4]，因此迫切需要探索新的輔助治療方法。近年來，基因靶向治療和免疫治療等顯示出良好的應用前景，但治療靶點的選擇及其功能機制仍需進一步探索。

癌－睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）是一類在多種腫瘤組織中表達，在除睪丸以外的正常組織中幾乎不表達的腫瘤相關抗原，因而被認為是腫瘤免疫治療的理想靶點[5]。OY-TES-1 是CTA 家族成員之一，又稱頂體素結合蛋白（acrosin binding protein，ACRBP）[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，OY-TES-1于包括HCC在內的多種腫瘤中高表達，其表達與患者的預后不良相關[7]。在HCC 細胞株中干擾OY-TES-1表達，能夠抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力，導致細胞周期阻滯，促進腫瘤細胞凋亡[8-9]。目前，OY-TES-1 影響HCC 惡性生物學行為的分子機制尚不明確。本研究通過生物信息學分析，探討OY-TES-1 潛在的生物學功能和可能參與的信號通路，從中篩選關鍵分子進行實驗驗證，為探索HCC治療靶點的選擇及其功能機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本 36例HCC 及配對癌旁正常組織，均來源于廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科手術患者，組織離體后取材置于液氮保存，標本于術后經病理確診。標本收集經患者知情同意和廣西醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2 細胞 人源HCC 細胞株BEL-7404、HepG2、BEL-7402、SMMC-7721 購自中國科學院上海細胞生物學研究所，使用含10%胎牛血清（FBS，加拿大Wisent公司）的DMEM（加拿大Wisent公司）于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 生物信息學分析 LinkedOmics數據庫（http://www.linkedomics.org/）篩選OY-TES-1 表達正相關基因集。DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）功能富集分析。GEPIA數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）用于分析HCC 樣本中OY-TES-1和丙酮酸激酶M2型（PKM2）的表達及表達相關性。

1.4 總RNA提取及實時熒光定量PCR（qPCR） 采用RNA 提取試劑盒（南京諾唯贊公司，#RC101-01）提取標本和細胞株RNA。分光光度計（北京天根公司）檢測RNA 濃度和吸光度值。cDNA 逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊公司，#R323-01）將RNA 逆轉錄成cDNA。使用SYBR 染料法行qPCR（南京諾唯贊公司，#Q711-02）檢測，反應條件如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共計40 個循環(huán)反應。Fold Change=2-△△Ct法分析結果數據。引物序列見表1，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR擴增引物序列

1.5 細胞轉染 按照LipofectamineTM3000（美國Invitrogen 公司）轉染試劑說明書，將siRNA（陰性對照、OY-TES-1 siRNA）分別轉染至HCC 細胞，48h 后收集細胞進行后續(xù)實驗。OY-TES-1 siRNA 序列（sense：5’-CGUGGAAGAGCUCCUAGAATT-3’；antisense：5’-UUGUAGGAGCUCUUCCACGTT-3’）由蘇州吉瑪公司合成。

1.6 Western blotting 依照蛋白提取試劑盒（北京索萊寶公司）操作說明提取細胞株總蛋白，BCA 法進行蛋白濃度檢測，樣品經變性后上樣。依次進行電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯影曝光。OY-TES-1 抗體（美國santa cruz 公司，#sc-390594）（1∶100 稀釋），PKM2 抗體（美國cell signaling公司，#4053）（1∶1 000稀釋），抗小鼠二抗（美國abcam公司，#ab6728）（1∶5 000稀釋）。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，配對資料組間比較采用配對t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法；采用Spearman秩相關分析表達的相關性；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OY-TES-1可能影響HCC能量代謝相關通路 通過LinkedOmics 數據庫查找371例HCC RNA-seq 測序數據，以表達相關系數大于0.3 為標準，篩選獲得1 001個與OY-TES-1表達正相關的基因集。對此基因集進行GO 和KEGG 分析，結果顯示OY-TES-1 主要富集于多糖合成、脂代謝和碳水化合物代謝等細胞能量代謝相關通路，見圖1、圖2。隨后，在OY-TES-1 表達正相關的基因集中，尋找參與細胞能量代謝相關的關鍵調節(jié)基因，PKM2型基因成為潛在候選基因。

2.2 HCC中OY-TES-1和PKM2高表達且具有較強的表達相關性 利用GEPIA 數據庫對369例HCC和50例正常肝組織的RNA-seq 進行分析，結果顯示：OY-TES-1 和PKM2 在HCC 中的表達均顯著高于正常肝組織，且兩者在HCC組織中表達呈正相關關系（r=0.3，P＜0.001），見圖3。

為驗證上述結果，本研究收集36例HCC 及其配對癌旁組織行qPCR檢測，結果顯示：HCC組織中OY-TES-1（癌組織：0.58±0.95vs癌旁組織：0.36±0.61）（t=2.339，P＜0.05）和PKM2（癌組織：0.14±0.17vs癌旁組織：0.08±0.14）（t=2.622，P＜0.05）的表達都高于癌旁組織，且兩者的表達呈正相關關系（r=0.482，P＜0.001），見圖4。

隨后，為了了解OY-TES-1 和PKM2 mRNA 表達與患者臨床參數的關系。以OY-TES-1 和PKM2在36例HCC組織中mRNA 表達的中位數為標準（高于中位數為高表達組，否則為低表達組），對兩者的mRNA表達與患者性別、年齡、WHO分級等臨床病理參數進行分析，統(tǒng)計學分析尚未發(fā)現(xiàn)有顯著相關性，見表2。

圖1 OY-TES-1表達正相關基因集GO分析

圖2 OY-TES-1表達正相關基因集KEGG分析

圖3 GEPIA數據庫分析HCC中OY-TES-1和PKM2 mRNA的表達及表達相關性

圖4 qPCR檢測HCC中OY-TES-1和PKM2 mRNA的表達及表達相關性

表2 OY-TES-1和PKM2 mRNA的表達與HCC患者臨床參數的關系n

2.3 下調OY-TES-1表達對PKM2表達的影響 為篩選合適的細胞株進行干擾實驗，本研究通過qPCR和Western blot分別檢測HCC細胞株BEL-7404、HepG2、BEL-7402、SMMC-7721 中OY-TES-1 和PKM2 的表達情況。結果顯示：OY-TES-1 和PKM2在HepG2和BEL-7404中mRNA和蛋白表達相對較高，見圖5。因此，選擇這兩株細胞進行干擾試驗。

將OY-TES-1 siRNA 轉 染HepG2 和BEL-7404細胞48 h 后進行檢測，qPCR 結果顯示：OY-TES-1 mRNA表達量在HepG2和BEL-7404細胞中分別為0.69±0.06、0.62±0.07，下調至60%左右；PKM2 mRNA表達量在HepG2 和BEL-7404 細胞中分別為0.73±0.09、0.75±0.07，下調至70%左右。Western blot結果顯示：隨著OY-TES1-1 表達下調，兩株HCC 細胞中PKM2蛋白表達也隨之明顯下調，見圖6。以上結果提示HCC 中OY-TES-1 對PKM2 表達具有調節(jié)作用。

圖6 HCC細胞株中下調OY-TES-1影響PKM2的表達

3 討論

近年來，HCC的發(fā)病率和病死率在全球范圍內呈上升趨勢，據統(tǒng)計全球每年約有70萬例新發(fā)HCC患者，其中我國約占一半[10]，為此迫切需要尋找新的HCC 輔助治療靶點。目前一些CTA 疫苗（如NYESO-1、MAGE）已用于臨床試驗階段并取得一定療效，顯示CTA具有臨床應用前景[11]。OY-TES-1作為CTA 家族成員之一，前期研究發(fā)現(xiàn)OY-TES-1 具有免疫原性，在部分HCC患者血清中檢出抗OY-TES-1抗體[12]，但是OY-TES-1影響HCC惡性生物學行為的具體機制及調控分子目前還未見報道。

生物信息學是近年來生命科學領域迅速發(fā)展的新興學科，它通過對基因序列中表達的結構功能信息進行檢索和分析，為后繼實驗提供理論指導。在本研究中，我們首先通過LinkedOmics 數據庫中HCC 樣本的測序結果，獲得與OY-TES-1 表達顯著正相關的1 001 個基因集。隨后，通過DAVID 數據庫研究OY-TES-1 潛在的生物學功能，發(fā)現(xiàn)該基因主要富集于多糖合成、脂代謝和碳水化合物代謝等細胞能量代謝通路。結合LinkedOmics數據庫分析結果，進一步篩選出參與細胞能量代謝的關鍵調節(jié)基因PKM2。

PK是糖酵解途徑中三大關鍵限速酶之一，能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸轉化為丙酮酸[13]，對細胞生長和增殖具有重要的調節(jié)作用[14]。PK 包括L 型和M型，M型又分為M1和M2亞型。PKM2特異性表達于干細胞和腫瘤細胞等，因此也被稱為腫瘤特異性丙酮酸激酶。研究發(fā)現(xiàn)，HCC 中高表達的PKM2能夠調節(jié)HCC細胞能量代謝進而影響HCC的惡性生物學行為[15]。為此推測，OY-TES-1 也可能通過PKM2 影響HCC 細胞能量代謝從而影響HCC 的惡性生物學行為。

為證實上述推測，本研究首先利用GEPIA數據庫進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，HCC組織中OY-TES-1 和PKM2 都呈高表達，兩者具有較強的表達相關性。隨后，收集36例HCC和配對癌旁組織進行qPCR驗證，結果顯示HCC組織中OY-TES-1 和PKM2 的表達都顯著高于癌旁組織，且兩者的表達呈正相關關系（P＜0.05）。統(tǒng)計學分析未發(fā)現(xiàn)OY-TES-1 和PKM2的表達與HCC患者臨床參數有顯著相關性，可能與研究樣本數量偏少有關，仍有待進一步探索。

本研究中，在HCC 細胞株HepG2 和BEL-7404中干擾OY-TES-1 的表達，結果顯示，PKM2 的mRNA 和蛋白表達也隨之下調。已知腫瘤細胞為了維持自身的生長和增殖，對葡萄糖的攝取遠大于正常細胞，更偏向于利用糖酵解途徑生成乳酸而取代正常細胞的有氧氧化，這種現(xiàn)象被稱為瓦博格效應（warburg effect）[16]。已有研究表明，HCC 中PKM2 表達升高能夠促進HCC 瓦博格效應的發(fā)生[17]。本研究的實驗雖然證實OY-TES-1 可影響PKM2的表達，但是OY-TES-1是否通過調節(jié)PKM2的表達從而影響HCC 細胞的能量代謝，導致HCC瓦博格效應的發(fā)生仍有待研究。