唐 虹，楊 洋，劉 曉

（四川省綿陽(yáng)市中心醫(yī)院兒科，綿陽(yáng) 621000）

流感是一種在全球流行的具有高度傳染性的急性呼吸道疾病，其發(fā)病率和死亡率較高[1-2]。流感病毒極易發(fā)生變異，以至于人類(lèi)機(jī)體很難對(duì)其產(chǎn)生免疫力[3]。由于西藥的大量使用，流感病毒也容易產(chǎn)生耐藥性[4]。因此，尋找新的高效藥物對(duì)流感的治療具有重要意義。山莨菪堿常用來(lái)治療小兒肺炎，并且其效果也得到臨床上的肯定[5]。但是山莨菪堿對(duì)流感病毒引起的肺炎損傷是否具有保護(hù)作用尚且未知。本研究以流感病毒甲型鼠肺適應(yīng)株（FM1）滴鼻感染小鼠建立病毒性肺炎模型，探討山莨菪堿對(duì)小鼠肺組織中氧化應(yīng)激及炎性損傷的影響，揭示其作用機(jī)制與Toll樣受體3（Toll-like receptors,TLR3）/TRIF3 信號(hào)通路的關(guān)系，為山莨菪堿用于治療流感肺損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只SPF 級(jí)BALB/C 裸鼠，體重18～20 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和處置遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)章程。

1.2 藥物與主要試劑 山莨菪堿（貨號(hào)：83377-50-8）購(gòu)自上?？祈樕锟萍加邢薰?；FM1流感病毒（血凝滴度1∶128）由中國(guó)中醫(yī)藥研究院饋贈(zèng)；達(dá)菲（貨號(hào)：B1354）購(gòu)自瑞士巴塞爾豪夫邁羅氏公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）所需試劑均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；引物均由上海生工設(shè)計(jì)合成；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD 公司。

1.3 動(dòng)物分組及流感病毒性肺損傷模型的建立 將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為對(duì)照組、模型組、達(dá)菲組、山莨菪堿低劑量組、山莨菪堿中劑量組、山莨菪堿高劑量組。除對(duì)照組外，其他5組均建立流感病毒性肺損傷模型：小鼠在乙醚淺度麻醉下，從鼻腔滴入FM1流感病毒液（0.05 mL/g）[6]。對(duì)照組同法滴入無(wú)菌生理鹽水。

1.4 給藥方法 各組小鼠分別灌胃給藥，2次/d，達(dá)菲劑量為27.5 mg/kg，山莨菪堿高、中、低劑量分別為3 mg/kg、1.5 mg/kg、0.75 mg/kg。對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水。給藥第7 天感染小鼠，感染后連續(xù)給藥7 d。

1.5 小鼠肺指數(shù) 末次給藥2 h后，稱(chēng)體重，處死小鼠，迅速摘取肺臟，去除氣管、肺門(mén)淋巴結(jié)等組織，以生理鹽水洗滌2次，用濾紙吸干肺臟表面水分，稱(chēng)肺重，計(jì)算肺指數(shù)。肺指數(shù)=肺重(g)/體重(g)×100%。

1.6 小鼠肺組織病理檢查 取部分肺組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，行蘇木精－伊紅（HE）染色，封片，顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理?yè)p傷情況。

1.7 小鼠肺組織氧化應(yīng)激及炎癥因子水平檢測(cè) 取部分肺組織，制成組織勻漿，離心，取上清分裝，于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。采用ELISA 法檢測(cè)各組小鼠肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細(xì)胞介素（IL）-6的水平。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

1.8 qPCR 法檢測(cè)小鼠肺組織TNF-α、IL-6、TLR3、TRIT mRNA 表達(dá)及病毒載量 充分研磨肺組織，Trizol 法提取總RNA，使用微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA 濃度和純度，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)要求配制反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列如下：TNF-α 上游：5’-ATGTGGCAAGAGATGGGGAA-3’，下游：5’-CTCACACCCCACATCTGTCT-3’；IL-6 上游：5’-CTCATTCTGTCTCGAGCCCA-3’，下游：5’-CTGTGAAGTCTCCTCTCCGG-3’；TLR3 上 游：5’-TCTTCCCTGGAACACCTGAA-3’，下游：5’-AGATTACTGCAGCCCACCTT-3’；TRIT 上游：5’-CAGGAAGAAGAGGGCCAGAT-3’，下游：5’-TTCAACAAAGATAGCGCCCG-3’；GAPDH上游：5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

采用qPCR 法檢測(cè)病毒載量，提取上述基因的DNA，以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增1 kb片段后制備反應(yīng)體系30 μL，按照Real Master Mix SYBR Green（北京天根生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取ABI 專(zhuān)用光學(xué)八連管，反應(yīng)體系：DNA 2 μL，上、下游引物各2 μL、2×SuperReal PreMix 13.5 μL、RNase-free ddH2O 補(bǔ)足至30 μL；反應(yīng)條件：95 ℃4 min，95 ℃30 s，59 ℃30 s，68 ℃35 s，72 ℃30 s，共40 次循環(huán)，應(yīng)用ABI 7500 型熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，讀取數(shù)據(jù)[7]。

1.9 Western blotting 法檢測(cè)小鼠肺組織中干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）蛋白表達(dá) 將肺組織充分研磨，加入RIPA 裂解液，于冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min；取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min；電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；洗膜，加入IRF3一抗（1∶1 000，美國(guó)Santa Cruz 公司），4 ℃冰箱過(guò)夜孵育；洗膜，加二抗（1∶2 000，美國(guó)Santa Cruz 公司），室溫下孵育2 h；ECL發(fā)光、顯色，凝膠成像儀拍照，應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組小鼠肺組織病理改變 對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯的病理?yè)p傷現(xiàn)象；模型組肺泡出現(xiàn)病變，肺泡可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管出現(xiàn)明顯的充血現(xiàn)象，肺組織結(jié)構(gòu)破壞；與模型組比較，達(dá)菲組肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞和血管充血明顯減少，肺組織損傷得到顯著改善，組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相近；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組肺泡炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少，血管充血逐漸減輕，肺組織損傷逐漸改善；山莨菪堿高劑量組肺組織結(jié)構(gòu)與達(dá)菲組相近，見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠肺組織HE染色圖（×200）

2.2 6組小鼠肺指數(shù)和肺組織病毒載量比較 與對(duì)照組比較，模型組肺指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達(dá)菲組肺指數(shù)和病毒載量顯著降低（P＜0.05）；與達(dá)菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組肺指數(shù)和病毒載量顯著升高（P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達(dá)菲組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；山莨菪堿降低小鼠肺指數(shù)和病毒載量的作用呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 6組小鼠肺組織SOD和MDA水平比較 與對(duì)照組比較，模型組肺組織SOD活性顯著降低，MDA水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達(dá)菲組肺組織SOD 活性顯著升高，MDA水平顯著降低（均P＜0.05）；與達(dá)菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組肺組織SOD 活性顯著降低，MDA水平顯著升高（均P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達(dá)菲組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；山莨菪堿對(duì)肺組織SOD和MDA的作用呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 山莨菪堿對(duì)肺炎小鼠肺組織中SOD活性及MDA水平的影響

2.5 山莨菪堿對(duì)肺炎小鼠肺組織炎性因子TNF-α及IL-6水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠的肺組織TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達(dá)菲組肺組織TNF-α、IL-6 水平顯著降低（P＜0.05）；與達(dá)菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組肺組織TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達(dá)菲組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；山莨菪堿對(duì)小鼠肺組織炎性因子TNF-α、IL-6 的抑制作用呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

2.4 6組小鼠肺組織TNF-α、IL-6、TLR3 及TRIT mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，模型組肺組織TNF-α、IL-6、TLR3和TRIT mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達(dá)菲組TNF-α、IL-6、TLR3 和TRIT mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）；與達(dá)菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組TNF-α、IL-6、TLR3 和TRIT mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（均P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達(dá)菲組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；山莨菪堿對(duì)小鼠肺組織TNF-α、IL-6、TLR3 及TRIT mRNA 表達(dá)的抑制作用呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05），見(jiàn)圖5、圖6。

2.7 6組小鼠肺組織IRF3 蛋白表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，模型組肺組織IRF3蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，山莨菪堿低、中、高劑量組和達(dá)菲組肺組織IRF3 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與達(dá)菲組比較，山莨菪堿低、中劑量組肺組織IRF3 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），山莨菪堿高劑量組與達(dá)菲組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；山莨菪堿對(duì)小鼠肺組織IRF3 蛋白表達(dá)的抑制作用呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

圖4 山莨菪堿對(duì)肺炎小鼠肺組織炎性因子TNF-α及IL-6水平的影響

圖5 山莨菪堿對(duì)肺炎小鼠肺組織TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)的影響

圖6 山莨菪堿對(duì)肺炎小鼠肺組織TLR3 mRNA、TRIT mRNA表達(dá)的影響

圖7 山莨菪堿對(duì)肺炎小鼠肺組織IRF3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

山莨菪堿是一種從茄科植物山莨菪中提取的生物堿，其為非亞型選擇性毒蕈堿，可作為煙堿型膽堿能受體拮抗劑[8]。山莨菪堿與阿托品和東莨菪堿有類(lèi)似的藥理作用，其效力低于阿托品和東莨菪堿，且毒性較低[9-10]。夏錫儀等[11]、Zheng等[12]研究指出，山莨菪堿在急性肺損傷中可發(fā)揮保護(hù)作用。胡喬華等[13]發(fā)現(xiàn)，山莨菪堿可改善膿毒性休克大鼠急性肺損傷。杜寧等[14]在開(kāi)胸術(shù)后急性肺損傷患者中發(fā)現(xiàn)，山莨菪堿可升高患者血中TNF-α、IL-6、IL-10、超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）和降鈣素原（PCT）水平，抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)從而減輕肺損傷。以上研究結(jié)果均提示山莨菪堿對(duì)于肺損傷具有保護(hù)作用。

SOD 是生物體內(nèi)清除超氧陰離子自由基的一種重要酶，其能有效地使機(jī)體抗御氧自由基的毒性。MDA 是衡量體內(nèi)自由基代謝水平和反映機(jī)體受氧化損傷程度的敏感指標(biāo)。本研究中，山莨菪堿能夠提高流感病毒性肺損傷小鼠肺組織中的SOD活性，降低MDA 含量，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。提示山莨菪堿具有一定的抗氧化能力，其肺損傷保護(hù)作用可能與抗氧化特性有關(guān)。TNF-α、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子作為重要的炎癥介質(zhì)參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，山莨菪堿低、中、高劑量組肺組織TNF-α、IL-6表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。提示山莨菪堿能夠明顯抑制流感病毒誘導(dǎo)的肺損傷小鼠肺組織內(nèi)炎癥反應(yīng)，減輕肺組織炎癥損傷程度，這與HE染色結(jié)果相一致。

TLR屬于天然免疫的蛋白質(zhì)分子，其可通過(guò)識(shí)別病原體等而發(fā)揮抗病毒的作用，其中TLR3/TRIF信號(hào)通路在機(jī)體免疫系統(tǒng)等多種相關(guān)疾病中可發(fā)揮重要作用，TLR3 可招募TRIF 而促進(jìn)下游炎性因子表達(dá)，進(jìn)而引起機(jī)體炎癥反應(yīng)[15]。TLR3/TRIF 信號(hào)通路活化可促進(jìn)IRF3的表達(dá)，進(jìn)而促使炎癥因子分泌，并可參與機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答等多種病理過(guò)程[16]。研究表明，脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中IRF3的表達(dá)水平升高，IRF3高表達(dá)可增加IL-6和IL-8等炎癥因子的分泌量進(jìn)而加重急性肺損傷[17]。朱珊等[18]通過(guò)呼吸機(jī)誘導(dǎo)肺損傷模型，qPCR、ELISA 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，損傷肺組織中TLR3、TLR4 的表達(dá)異常升高，提示TLR3、TLR4 的表達(dá)與肺組織的損傷密切相關(guān)。此外，王麗等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在流感病毒誘導(dǎo)的肺損傷小鼠中，TLR3、TLR4 的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)NFκB 和TNF-α 表達(dá)量升高。本研究發(fā) 現(xiàn)，TLR3、TRIT、IRF3的表達(dá)在流感病毒誘導(dǎo)的肺損傷小鼠中明顯升高，山莨菪堿能夠明顯降低小鼠肺組織中TLR3、TRIT、IRF3的表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)性，說(shuō)明山莨菪堿可能通過(guò)抑制TLR3/TRIF信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮病毒性肺損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，山莨菪堿對(duì)流感病毒致肺損傷小鼠具有保護(hù)作用，可減輕肺組織損傷程度，其作用機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)、抑制TLR3/TRIF信號(hào)通路有關(guān)。