吳建民，王建發(fā)，武 瑞

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院 黑龍江省牛病防治重點實驗室，黑龍江 大慶 163319)

乳脂肪作為牛乳的重要營養(yǎng)物質(zhì)及關(guān)鍵評價指標備受廣大研究者關(guān)注。乳脂肪含有人體必需的礦物質(zhì)以及脂溶性維生素。有研究證明，乳脂肪中豐富的共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)對于下調(diào)人體膽固醇[1]與低密度脂蛋白含量[2]、抵抗動脈粥樣硬化[3]等具有重要功效。奶酪作為牛乳進一步加工的產(chǎn)品在國際乳制品高端市場占有重要地位，而乳脂肪對于奶酪的風(fēng)味具有重要影響，不僅因為合成乳脂肪的脂肪酸(fatty acid,FA)本身是風(fēng)味物質(zhì)，同時也是奶酪中甲基酮、仲醇、內(nèi)酯、酯等風(fēng)味物質(zhì)的前體物[4]。因此，安全有效地提高牛乳中乳脂肪含量是加強我國乳業(yè)在國際市場上核心競爭力的必要手段之一。

消化道微生物與機體的生理代謝、免疫防御[5]、消化吸收[6]和行為方式等聯(lián)系密切。在奶牛體內(nèi)，瘤胃微生物參與眾多生理作用，是保證其消化及能量循環(huán)有序進行的必要基礎(chǔ)[7]。日糧中的營養(yǎng)物質(zhì)首先通過瘤胃微生物的降解作用轉(zhuǎn)化為可供奶牛機體利用的小分子物質(zhì)，再進入各個系統(tǒng)發(fā)揮功能，對奶牛的生產(chǎn)性能具有顯著影響[8]，其正常的生理狀態(tài)更是保證奶牛機體穩(wěn)態(tài)的重要前提[9]。近年來的研究熱點主要集中在微生物影響宿主健康、調(diào)節(jié)宿主生理機能[10]等方面的潛在作用，而乳脂肪合成前體物的生成均受到瘤胃微生物的調(diào)節(jié)作用，其合成情況決定最終乳中脂肪含量的高低。因此，了解瘤胃微生物對乳脂肪合成前體物的生理功能、作用方式及影響因素，對提高牛乳中脂肪含量具有重要意義。

1 乳脂肪合成過程及影響因素

1.1 乳脂肪成分及乳脂肪酸合成途徑乳脂肪在牛乳中含量為3%～5%，主要成分為甘油三酯(triglyceride,TG)，約占全部乳脂肪的98%，其余物質(zhì)為二酰甘油(diacylglycero,DAG)、單酰甘油(monoacylglycerol,MAG)、磷脂(phospholipid,PL)、糖脂、膽固醇(cholesterol,CHO)、游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)以及脂溶性維生素等。

乳脂肪由奶牛乳腺上皮細胞(dairy cow mammary epithelial cells,DCMECs)對脂肪酸加工而成。其合成所用的脂肪酸通常認為有兩種來源：一種以瘤胃內(nèi)微生物酵解日糧中碳水化合物而產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸為主要前體物質(zhì)，再由DCMECs從頭合成，包括中短鏈脂肪酸(C4～C14)和50%的C16脂肪酸，占牛乳中總脂肪酸的40%～45%。另一種以瘤胃內(nèi)微生物分解日糧中脂肪而產(chǎn)生的脂肪酸為主要前體物質(zhì)，進入血液循環(huán)流經(jīng)乳腺組織時由DCMECs直接攝取利用，包括全部長鏈脂肪酸(C16以上)和余下50%的C16脂肪酸，占牛乳中總脂肪酸的55%～60%[11]；此外，奶牛體脂動員時血漿內(nèi)與白蛋白結(jié)合的游離脂肪酸也可以經(jīng)脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)水解后被DCMECs利用合成乳脂肪[12]，尤其當(dāng)奶牛機體處于能量負平衡狀態(tài)時，DCMECs主要利用經(jīng)體脂動員而獲得的長鏈脂肪酸合成乳脂肪。

1.2 影響乳脂肪合成的非自身代謝性因素乳脂肪含量是牛乳中最易產(chǎn)生浮動的指標之一，不同的飼養(yǎng)環(huán)境、管理方式、日糧結(jié)構(gòu)，奶牛自身的健康狀況，不同品種、胎次、泌乳時期、年齡等多種因素都可對最終牛乳中乳脂肪含量產(chǎn)生不同程度的影響。研究表明，在日糧中添加飽和脂肪酸對乳脂肪合成具有促進的作用；添加脂肪或油脂可以影響乳脂肪中脂肪酸的組成；在奶牛日糧中添加植物油，可以提高乳脂肪中反式脂肪酸的比例。另有研究發(fā)現(xiàn)，在高比例粗飼料的日糧中添加葵花子油時，乳中C18:0和C18:19顯著提高[13]；當(dāng)日糧中精粗比達到3∶2時，會引起乳脂肪合成下降[14]。當(dāng)奶牛發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒時，乳脂肪率一般下降到0.8%～1.0%；當(dāng)環(huán)境溫度超過30℃時，奶牛遭受熱應(yīng)激可引發(fā)乳脂肪合成下降。中國荷斯坦奶牛的正常乳脂肪含量為3.5%～3.7%，而牦牛的乳脂肪含量可達到7.5%以上。通常情況下隨著奶牛生產(chǎn)胎次的增加，脂肪酸含量會逐漸降低[15]。

1.3 影響乳脂肪合成的自身代謝性因素奶牛日糧中碳水化合物經(jīng)過瘤胃微生物作用轉(zhuǎn)變?yōu)楸醄16]，在瘤胃內(nèi)進入不同的代謝途徑轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)，約有80%的VFA被瘤胃壁和網(wǎng)胃壁吸收，剩余的VFA經(jīng)消化道其他組織吸收后利用；日糧中脂類物質(zhì)經(jīng)過瘤胃微生物作用轉(zhuǎn)變?yōu)榉酋セ舅?non-esterified fatty acids,NEFA)和VFA。

瘤胃微生物對日糧營養(yǎng)元素的酵解作用是乳脂肪合成的始動因素。進入血液循環(huán)后經(jīng)由門靜脈的VFA有60%～84%被肝臟吸收[17]，約有80%的丙酸用于糖異生，是奶牛合成葡萄糖的主要來源[18]，但進入肝臟的NEFA主要來源于體脂動員，這些NEFA可以經(jīng)過β-氧化途徑生成Acetyl-CoA，其中一部分進入檸檬酸循環(huán)氧化代謝，另一部分被氧化生成β-羥丁酸等酮體物質(zhì)；或者被酯化生成TG后與載脂蛋白結(jié)合以極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)形式[19]從肝臟轉(zhuǎn)運入血。乳腺組織是前體物最終合成乳脂肪的場所，DCMECs將從頭合成而來的脂肪酸或從血液中攝取的NEFA進一步去飽和化后，再將其合成TG。合成TG的過程在DCMECs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進行，脂肪酸以脂酰輔酶A的形式酯化在α-磷酸甘油上[20]。

2 瘤胃微生物的代謝調(diào)控作用

2.1 瘤胃微生物的種類瘤胃微生物被喻為奶牛自身的“隱形器官”，通常包括細菌(1010～1011cells/mL)、真菌(103～106cells/mL)和原蟲(104～106cells/mL)[21]等。專性厭氧菌為瘤胃微生物主要成分，優(yōu)勢門水平細菌分別為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)，共有超過7 400個種水平細菌[22]。不同年齡奶牛瘤胃內(nèi)優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門[23]。HENDERSON等[7]應(yīng)用高通量測序技術(shù)對來自于世界各地的742頭反芻動物瘤胃內(nèi)容物進行檢測發(fā)現(xiàn)，奶牛品種、地理分布和日糧結(jié)構(gòu)等因素均對瘤胃微生物產(chǎn)生了一定的影響，但優(yōu)勢菌群大體相同；普雷沃菌屬(Prevotella)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)為屬水平優(yōu)勢菌。

2.2 瘤胃微生物的代謝調(diào)控作用大多數(shù)瘤胃微生物編碼碳水化合物降解酶或與碳水化合物降解相關(guān)的結(jié)合蛋白。依照作用底物不同，可以將瘤胃微生物分為纖維素降解類、淀粉降解類等。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、溶纖維真桿菌(Eubacteriumcellulosolvens)、棲瘤胃普雷沃菌(Prevotellaruminicola)、反芻動物真桿菌(Eubacteriumruminantium)等為瘤胃微生物中主要的纖維素降解菌。其中革蘭陰性菌的F.succinogenes與革蘭陽性菌的R.albus和R.flavefaciens為瘤胃內(nèi)相對豐度最高且纖維素降解能力最強的3個菌種。瘤胃中的真菌、原蟲等也可以降解纖維素[24]。這些微生物將日糧中纖維素類物質(zhì)逐步降解為單糖供機體利用。

嗜淀粉瘤胃桿菌屬、棲瘤胃普雷沃菌屬、牛鏈球菌屬、溶淀粉琥珀酸單胞菌屬、反芻獸新月形單胞菌屬、溶纖維丁酸弧菌屬、雙歧桿菌屬和梭菌屬等細菌，內(nèi)毛蟲屬和雙毛蟲屬等原蟲，以及瘤胃內(nèi)部分厭氧真菌幾乎全部可以產(chǎn)生α-淀粉酶，將淀粉水解為麥芽糖[25]后再進一步降解為單糖供機體利用。

瘤胃內(nèi)微生物的組成結(jié)構(gòu)亦會受到日糧中各營養(yǎng)物質(zhì)比例的影響。奶牛日糧為高脂肪低纖維結(jié)構(gòu)時，原蟲和真菌的數(shù)量會出現(xiàn)降低的趨勢，同時普雷沃菌屬、琥珀酸絲狀桿菌屬的相對豐度會下調(diào)，而牛鏈球菌屬會出現(xiàn)顯著升高[26]。當(dāng)奶牛日糧結(jié)構(gòu)為高粗料日糧時，纖維桿菌門相對豐度會顯著升高[27]。

3 瘤胃微生物對乳脂肪合成的影響

3.1 瘤胃微生物調(diào)節(jié)揮發(fā)性脂肪酸生成的機制瘤胃微生物通過自身合成的糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)以及碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding modules,CBMs)等酶類將日糧中碳水化合物酵解為二糖或單糖形式，經(jīng)過瘤胃內(nèi)進一步代謝后以Acetyl-CoA為底物形式合成VFA(主要為乙酸和丁酸)，其中合成乙酸的途徑主要有4種：乙酸磷酸轉(zhuǎn)移酶-抑酸激酶(PTA-ACK)途徑，Acetyl-CoA的硫酯鍵被磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphotransacetylase,PTA,EC：2.3.1.8)磷酸化降解，生成乙酰磷酸，再被乙酸激酶(acetate kinase,ACK,EC：2.7.2.1)催化[28]，產(chǎn)生乙酸與ATP；乙酰輔酶A生成酶(ACS(ADP))途徑，Acetyl-CoA經(jīng)乙酰輔酶A生成酶[acetyl-CoA synthetase(ADP-forming),ACS(ADP),EC：6.2.1.13]作用后產(chǎn)生乙酸[28]；乙酸-琥珀酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(ASCT)途徑，Acetyl-CoA的輔酶A基團經(jīng)乙酸-琥珀酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(acetate-succinate CoA-transferase,ASCT,EC：2.8.3.18)作用轉(zhuǎn)移給琥珀酸[27]而產(chǎn)生乙酸與琥珀酸輔酶A；乙酰輔酶A水解酶(ACH)途徑，Acetyl-CoA的硫酯鍵被乙酰輔酶A水解酶/硫酯酶(acetyl-CoA hydrolase/thioesterases,ACH,EC：3.1.2.1)水解[28]，進而生成乙酸。此外，部分微生物還可以在瘤胃內(nèi)厭氧條件下利用CO2為底物，通過Wood-Ljungdahl pathway途徑[29]產(chǎn)生乙酸。

以Acetyl-CoA為底物合成丁酸的途徑主要包括Acetyl-CoA向丁酰輔酶A(butyryl-CoA)轉(zhuǎn)變的中心途徑(central pathway)和butyryl-CoA向丁酸轉(zhuǎn)變兩個過程[30]，后者一般有3種途徑：通過磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶(phosphotransbutyrylase,PTB)和丁酸激酶(butyrate kinase,BK)產(chǎn)生丁酸，稱為PTB-BK途徑；在乙酸存在時通過輔酶A轉(zhuǎn)移酶(acetate CoA-transferase)產(chǎn)生丁酸，稱為BCACT途徑；在乙酰乙酸鹽存在時通過輔酶A轉(zhuǎn)移酶(butyryl-CoA-acetoacetate CoA-transferase)產(chǎn)生丁酸[31]，稱為BCAACT途徑。

3.2 瘤胃微生物調(diào)節(jié)中長鏈脂肪酸生成的機制瘤胃微生物利用自身合成的脂解酶[25]水解日糧中脂類物質(zhì)產(chǎn)生甘油、半乳糖和不飽和的NEFA，在進一步的氫化作用下，不飽和的NEFA被飽和，半乳糖和甘油轉(zhuǎn)化為VFA，小部分NEFA和大部分VFA經(jīng)瘤胃壁吸收入血。此外，一部分脂類以過瘤胃脂肪和菌體磷脂膜的形式到達十二指腸，經(jīng)胰脂酶作用后轉(zhuǎn)變?yōu)镹EFA，進而被空腸吸收，再轉(zhuǎn)化為低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)，經(jīng)過淋巴管運輸?shù)竭_乳腺組織處。

不同種類的瘤胃微生物能夠作用于不同的底物，其中黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌分泌纖維素降解酶的能力較強；嗜淀粉瘤胃桿菌和牛鏈球菌對淀粉降解的能力較強[32]；脂解厭氧弧桿菌降解脂類物質(zhì)的能力較強[33]。瘤胃內(nèi)的厭氧真菌以及原蟲等微生物亦有不同程度的降解能力，但與瘤胃內(nèi)脂類物質(zhì)降解作用相關(guān)微生物的報道相對較少，有待研究人員的進一步闡明。

4 未來展望

綜上可見，在不同日糧結(jié)構(gòu)下的瘤胃微生物具有不同的特點。高脂肪日糧時會增加與脂類降解相關(guān)的微生物同時降低與碳水化合物類降解相關(guān)的琥珀酸絲狀桿菌等微生物，而高纖維日糧時則會增加與碳水化合物類降解相關(guān)的微生物；而具備專一代謝功能的瘤胃微生物受到日糧結(jié)構(gòu)的影響后其含量會發(fā)生變化，進而與之相關(guān)的代謝物產(chǎn)量會出現(xiàn)升高或降低，從而影響奶牛最終的生產(chǎn)性能指標。是否可以利用瘤胃微生物種間、群落間針對不同底物所表現(xiàn)出的優(yōu)勢物種情況以及瘤胃內(nèi)環(huán)境與微生物的互作機制，通過人為干預(yù)，改變瘤胃中與乳脂肪合成前體物相關(guān)的微生物及其所編碼的碳水化合物降解酶類和脂類物質(zhì)降解酶類的含量與結(jié)構(gòu)，進而提高最終牛乳中乳脂肪的含量，有待進一步的研究。明確這一問題對構(gòu)建瘤胃微生物調(diào)節(jié)乳脂肪合成網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。