李文桂 陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所400016

銅綠假單胞菌是一種常見的機(jī)會(huì)致病菌[1]，Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）是其主要致病因子，可協(xié)助其逃避巨噬細(xì)胞的吞噬和降解[2]。 其中PcrV 蛋白是一種T3SS 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將細(xì)菌產(chǎn)生的毒素蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞內(nèi)，干擾細(xì)胞的功能，引起細(xì)胞死亡[3-4]，提示PcrV 蛋白作為免疫調(diào)控靶點(diǎn)是一種有希望的疫苗分子。 本文擬就PcrV 蛋白分子、PcrV 抗體、核酸疫苗以及重組鼠傷寒沙門菌（St）疫苗等的研制現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

一、PcrV 蛋白

弗氏佐劑（FA）是一種水包油制劑，完全FA（CFA）含有失活的分枝桿菌，不完全FA（IFA）則不含有，兩者都能增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答[5]。 Sawa 等[6]將10 μg 重組PcrV 抗原 加FA皮下注射BALB/c 鼠， 注射后3 周皮下注射5×105CFU 銅綠假單胞菌PA103 株進(jìn)行攻擊，在攻擊后1 周發(fā)現(xiàn)肺組織的病變減輕，肺組織的細(xì)菌負(fù)荷下降，免疫組和對(duì)照組計(jì)數(shù)存活率分別為70%和0。Holder 等[7]將10 μg 重組PcrV 抗原加FA肌肉注射CF-1 鼠，在首次注射后2 周加強(qiáng)1 次，在首次注射后3 周顯示血清IgG 升高，4 周后制作15%體表面積的燒傷模型，同時(shí)皮下注射5×105CFU 銅綠假單胞菌M-2 株、SBI-N株和1071 株進(jìn)行攻擊， 在攻擊后1 周顯現(xiàn)3 個(gè)攻擊組焦痂和肺組織的細(xì)菌負(fù)荷顯著降低， M-2 攻擊組、SBI-N 攻擊組和1071 株攻擊組的存活率分別為80%、60%和40%， 而對(duì)照組為0。 Moriyama 等[8]將30 μg 截短型PcrV 抗原加FA 皮下注射BALB/c 鼠，在首次注射后30 d 加強(qiáng)1 次，在首次注射后60 d 腹腔注射5 mg 環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠的中性粒細(xì)胞減少， 在首次注射后63 d 腹腔注射5×106CFU 銅綠假單胞菌PA103 株進(jìn)行攻擊， 在攻擊后3 d 提示PcrV1-294免疫組和PcrV139-294免疫組的存活率均為65%， 而PcrV139-234免疫組和PcrV261-294免疫組均為20%； 被動(dòng)免疫試驗(yàn)提示PcrV1-294和PcrV139-294免疫組60 d 的抗血清可產(chǎn)生較好的保護(hù)力。

鋁佐劑是美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于臨床的佐劑之一，對(duì)DC、T細(xì)胞和B 細(xì)胞具有明顯的刺激作用，主要誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Th2型的免疫應(yīng)答[9]。 Markham 等[10]將10 μg 重組PcrV 抗原加鋁佐劑肌肉注射BALB/c 鼠， 顯現(xiàn)血清IgG 在注射后1～7 周升高，在注射后3 周達(dá)較高水平。

CpG 寡脫氧核苷酸序列（CpG ODN）是一種人工合成的核酸佐劑，可以模擬細(xì)菌DNA，促進(jìn)免疫細(xì)胞表達(dá)TLR9 受體，產(chǎn)生細(xì)胞因子，主要誘導(dǎo)Th1 型的免疫應(yīng)答[11]。 Naito 等[12]將10 μg 重組PcrV 抗原加10 μg 的CpG ODN 核酸佐劑滴鼻接種ICR 鼠，在初次接種后2 和3 周各加強(qiáng)1 次，初次接種后50 d 顯示血清IgG、IgG1 和IgG2a 升高，IgG1 與IgG2a比值大于1，支氣管肺泡灌洗液的IgA 升高；初次接種后55 d通過支氣管注射的途徑將1.5×106CFU 銅綠假單胞菌PA103株進(jìn)行攻擊，攻擊后7 d 發(fā)現(xiàn)免疫組的肺組織病變減輕，細(xì)菌負(fù)荷減少，免疫組和對(duì)照組計(jì)數(shù)存活率分別為73%和0。

Hamaoka 等[13]將10 μg 重組PcrV 抗原加FA、鋁佐劑和ODN 佐劑分別滴鼻接種ICR 鼠，初次接種后20 和40 d 各加強(qiáng)1 次，初次接種后60 d 證實(shí)血清IgG、IgG1 和IgG2a 升高，IgG1 與IgG2a 比值大于1，65 d 通過氣管內(nèi)注射將1.5×106CFU銅綠假單胞菌PA103 株進(jìn)行攻擊，在攻擊后1 d 發(fā)現(xiàn)免疫組的肺組織水腫顯著減輕，肺組織內(nèi)的過氧化物酶減少，肺組織的細(xì)菌負(fù)荷減少， 在免疫后7 d 證實(shí)PcrV 抗原加FA 組、PcrV 抗原加鋁佐劑組和PcrV 抗原加ODN 佐劑組的存活率分別為90.9%、81.8%和40.0%，而對(duì)照組為0。

三氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯[3-OXO-C12-HSL]是密度感應(yīng)系統(tǒng)LasRI 和RhlRI 蛋白的誘導(dǎo)劑， 可以調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌毒力因子的表達(dá)，影響宿主的免疫應(yīng)答[14]。 Golpasha 等[15]將10 μg 重組PcrV 抗原加10 μg 的3-OXO-C12-HSL 佐劑皮下注射BALB/c 鼠，在初次接種后2 和4 周各加強(qiáng)1 次，6 周后顯 示 血 清IgG、IgG1 和IgG2a 升 高，IgG1 和IgG2a 比 值 大 于1，7 周后皮下注射5×102CFU 銅綠假單胞菌PA01 株進(jìn)行攻擊，在攻擊后1 周顯示免疫組的肝脾腎組織的細(xì)菌負(fù)荷是對(duì)照組的1%，免疫組和對(duì)照組計(jì)數(shù)存活率分別為78%和0。

溶血素共調(diào)節(jié)蛋白1（HCP1）是一種依賴T6SS 的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將毒素蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞內(nèi)[16]。Yang 等[17]以PA01 株的基因組DNA 為模板擴(kuò)增PcrV28-294、OprI25-83 和HCP11-162 基 因， 將 它 們 融 合 為POH 基 因， 插 入pGEX-6P-2，得pGEX-POH。將30 μg 融合蛋白加鋁佐劑肌肉注射BALB/c 鼠，初次接種后2 和3 周各加強(qiáng)1 次，5 周發(fā)現(xiàn)血清IgG、IgG1 和IgG2a 升高，IgG1 與IgG2a 比值大于1，脾細(xì)胞明顯增殖， 并分泌高水平IL-4、IFN-γ 和IL-17A 等細(xì)胞因子， 此時(shí)用5×106CFU 銅綠假單胞菌PA01 株進(jìn)行氣管內(nèi)注射攻擊，在攻擊后1 d 顯示免疫組的肺組織病理減輕，支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平降低， 在攻擊后7 d 發(fā)現(xiàn)免疫組和對(duì)照組計(jì)數(shù)存活率分別為60%和0。

二、重組PcrV 抗體

PcrV 抗體結(jié)合PcrV 后可阻斷銅綠假單胞菌毒素蛋白的釋放，從而提高宿主的抵抗力，但用PcrV 抗體治療銅綠假單胞菌感染存在一定的毒副作用，這就需要改造PcrV 抗體，降低其免疫原性和毒性[18]。 Frank 等[19]和管章春等[20]先后制備了PcrV 的單克隆抗體，體外試驗(yàn)表明它們均具有較好的抗銅綠假單胞菌活性。 Neely 等[21]制作15%體表面積的CF-1 鼠燒傷模型， 在燒傷后1 h 皮下注射103CFU 銅綠假單胞菌SBI-N株、1071 株和M-2 株進(jìn)行感染， 感染后1、2 和3 d 腹腔注射100 μg 的PcrV-IgG 進(jìn)行免疫治療治療后1 周顯示SBI-N 攻擊組、M-2 攻擊組、1071 攻擊組和對(duì)照組的存活率分別為90%、80%、30%和0。 Wang 等[22]將5×106CFU 銅綠假單胞菌R4 株加10 μg 的PcrV-IgG 支氣管內(nèi)注射BALB/c 鼠，然后口服500 mg/kg 的頭孢他啶，1 次/d，連服7 d，在治療后7 d 發(fā)現(xiàn)抗體治療組的肺組織病理減輕， 肺細(xì)菌負(fù)荷是對(duì)照組的1%，計(jì)數(shù)存活率提示抗體治療組和對(duì)照組分別為100%和0。

雞蛋黃IgG（IgY）是一種經(jīng)濟(jì)有效的多克隆抗體，對(duì)靶抗原的親和力高，可以阻斷銅綠假單胞菌與宿主上皮細(xì)胞的相互作用[23]。Ranjbar 等[24]將100 μg 的PcrV-IgY 腹腔注射BALB/c鼠，在抗體注射后2 h 用2×107CFU 銅綠假單胞菌PA01 株進(jìn)行滴鼻感染， 感染后7 d 計(jì)數(shù)存活率表明IgY 治療組和對(duì)照組分別為70%和0。

三、PcrV 核酸疫苗

銅綠假單胞菌外毒素A（PEA）具有較強(qiáng)的免疫原性，將其免疫小鼠可產(chǎn)生較好的保護(hù)力[25]。 Jiang 等[26]以PA01 株的基因組DNA 為模板擴(kuò)增PEA 和PcrV 基因，分別插入pIRES的2 個(gè)位點(diǎn)得pIRES-PEA-PcrV， 將100 μg 重組質(zhì)粒加15 μg的CpG ODN1826 核酸佐劑肌肉注射BALB/c 鼠，在初次接種后2 和4 周各加強(qiáng)1 次，6 周后血清IgG 升高，脾細(xì)胞明顯增殖，并分泌高水平的IFN-γ 和IL-12，但I(xiàn)L-10 和IL-4 的分泌水平降低， 此時(shí)用5×107CFU 銅綠假單胞菌PA01 株進(jìn)行滴鼻攻擊，在攻擊后3 d 提示免疫組脾和肺的細(xì)菌負(fù)荷均顯著降低。

鞭毛的基本組成單元為鞭毛蛋白 （Fla），F(xiàn)la 可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，是一種有效的免疫原[27]。 Saha 等[28]將PcrV、PilA、OprF-I 的編碼基因分別插入pGACAG 獲得pCACAGPcrV/PilA/OprF-I， 各 取1 μg 的 重 組 質(zhì) 粒 組 成 混 合DNA 疫苗；采用基因槍轟擊法接種BALB/c 鼠，在初次接種后2 周加強(qiáng)1 次，初次接種后4 周提示血清IgG 和IgG1 升高，此時(shí)用5×105CFU 銅綠假單胞菌D4 株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后1 d 顯示免疫組支氣管肺泡灌洗液內(nèi)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增加，MIP-2 和IFN-γ mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平升高， 攻擊后10 d 提示免疫組和對(duì)照組的存活率分別為100%和0。

四、St 減毒株介導(dǎo)的PcrV 疫苗

St 的減毒株主要用于傷寒和副傷寒的免疫防治。Aguilera-Herce 等[29]分別以PA01 株和St 的14028 株基因組DNA 為模板分別擴(kuò)增PcrV 和SseJ 分泌序列， 將PcrV 基因插入pGEX-4T-2 獲得pGEX-PcrV， 將SseJ 基因插入pGEXPcrV 獲得pGEX-PcrV-SseJ， 與pWSK29 重組獲得pWSK29-PcrV-SseJ；將重組質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化St14028 株，篩選陽性重組菌， 免疫印漬提示陽性血清識(shí)別重組菌表達(dá)的PcrV 融合蛋白 （相對(duì)分子質(zhì)量為35 000）。 將2×105CFU 疫苗腹腔注射C57BL/6 鼠，在注射后3 周提示血清IgG 升高，脾細(xì)胞分泌高水平的TNF-α 和IL-6，此時(shí)腹腔注射9×106CFU 銅綠假單胞菌PA01 株進(jìn)行攻擊， 在攻擊后7 d 提示免疫組肺和脾的細(xì)菌負(fù)荷下降， 免疫組和對(duì)照組計(jì)數(shù)存活率分別為75.0%和12.5%。

五、結(jié)語

現(xiàn)有銅綠假單胞菌PcrV 蛋白疫苗產(chǎn)生的保護(hù)力通常較低，常須加用佐劑或與其他抗原進(jìn)行融合表達(dá)才能誘導(dǎo)有效的保護(hù)力；PcrV 抗體具有被動(dòng)保護(hù)作用，但不良反應(yīng)較大；核酸疫苗可誘導(dǎo)全面的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，但其有整合進(jìn)宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)；重組St 疫苗的表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白存在差異，表達(dá)水平較低。

隨著核基因組學(xué)、泛基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、高通量測(cè)序和反向疫苗學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，人們將對(duì)銅綠假單胞菌的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)進(jìn)行深入研究，從而發(fā)現(xiàn)PcrV蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；為了增加DNA 疫苗的免疫原性，對(duì)PcrV 抗原表位的序列進(jìn)行修飾，構(gòu)建PcrV 多抗原表位或免疫增強(qiáng)序列-PcrV 抗原表位的融合基因疫苗，構(gòu)建PcrV 表位-佐劑序列或不同抗原表位序列的融合基因疫苗。 同時(shí)應(yīng)積極開展新型疫苗載體的探索，將它們聯(lián)合起來，推動(dòng)銅綠假單胞菌PcrV 疫苗的研究躍上一個(gè)新的臺(tái)階。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突