馬楚晗，于亞男，劉啟文，車華松，趙加梅，胡秋霞，成家茂

大理大學 1.臨床醫(yī)學院，2.基礎醫(yī)學院解剖教研室，云南 大理 671000

肝纖維化由多種因素導致肝實質細胞壞死和膠原纖維異常沉積，以細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過量產生和沉積為主要表現，若不積極干預則有可能發(fā)展為肝硬化或肝癌。miRNA 是一類具有調控功能的內源性非編碼小分子RNA，參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程，已有研究證實miRNA的異常表達與肝炎、肝硬化和惡性轉化相關[1,2]。近年的研究表明，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中TGF-β/Smad 信號通路發(fā)揮重要的調控作用[2～4]；而該信號通路相關miRNAs 的調控是近年來新發(fā)現的基因表達調控方式，在調控不同狀態(tài)的肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）功能方面發(fā)揮決定性的作用，多種與TGF-β/Smad 信號通路相關聯(lián)的miRNA 如miR-19b、miR-33a、miR-130a/b、miR-200a、miR-101等，在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用[5]。miRNAs 與TGF-β/Smad 信號通路之間關系的研究不多，本文在此對近年的相關研究予以綜述。

1 TGF-β/Smad 信號轉導通路在肝纖維化中的作用機制

活化的HSCs 是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中最為關鍵的細胞之一，是ECM 的主要來源[6,7]。HSCs 在正常肝組織中處于靜息狀態(tài)，在嚴重肝病或肝受損時則被激活，轉化為肌成纖維細胞（myo-fibroblaster，MFB）；后者能產生大量ECM 并過量沉積，導致正常的肝組織結構被破壞，進而發(fā)生肝纖維化[8,9]。TGF-β/Smad 是肝纖維化的主要信號轉導通路，可抑制正常肝細胞增殖[3]，激發(fā)HSCs 的活化，從而促進ECM 的生成和沉積[10,11]；其中TGF-β1是促進肝纖維化的核心細胞因子，主要分布于正常肝的竇內皮細胞、Kupffer 細胞（KCs）中，其次為活化的HSCs 內，在肝纖維化過程中HSCs 表達TGF-β1水平持續(xù)升高[10]。

TGF-β/Smad 信號轉導通路主要在肝纖維化的炎性和炎癥后階段發(fā)揮作用。在炎性階段，KCs 被激活，促使細胞因子TGF-β1、PDGF、EGF 等大量釋放，刺激活化的HSCs 轉化為MFB；在炎癥后階段，HSCs 及MFB 可自分泌TGF-β1、TNF-α等因子，進一步促進自身活化[12]。在肝纖維化中，Smad 蛋白家族中的Smad3和Smad4蛋白可形成復合體轉位到細胞核中參與基因的調控，具有促纖維化作用；而Smad2和Smad7可以終止TGF-β的信號轉導，具有保護作用[4,10]。

肝細胞或HSCs 中TGF-β信號轉導減弱可有效抑制肝纖維化[13]。TGF-β活化后與細胞膜表面受體TGF-β Ⅱ型受體（TβRⅡ）結合，使之磷酸化而具有激酶活性，然后再招募結合TGF-β I 型受體（TβRI）形成二聚體受體復合物，并使TβRI 磷酸化具有激酶活性，活化的TβRI 進一步磷酸化其受體Smad蛋白[13,14]。Smad 蛋白家族包括3類：受體調節(jié)型Smads（RSmads），主要為Smad2、Smad3，可與活化的TβRI 直接作用并被磷酸化激活；共同調節(jié)型Smads（Co-Smads），主要為Smad4，能使Smad 復合物保持有效的轉錄活性；抑制性Smads（ISmads），主要有Smad6和Smad7，能競爭性結合TβRI，阻止RSmads 磷酸化[14]。R-Smads 和Co-Smads 均存在于胞質中，二者結合成復合物后向胞核內聚集，并通過和其他轉錄因子相互作用，或直接與DNA 結合來調節(jié)特定靶基因（如I 型膠原蛋白）的表達；TGF-β活化的同時，I-Smads 則與R-Smads 競爭性結合受體，反饋性抑制TGF-β的信號轉導[14,15]。

2 miRNA 對肝纖維化中TGF-β/smad 信號通路的調節(jié)

2.1 miRNA 的存在形式、特性及其作用

miRNA 是一類長約20～24個核苷酸的內生性非編碼小RNA，參與基因轉錄后表達調控。miRNA 自1993年被發(fā)現以來，已在動、植物及人類等真核生物中獲得鑒定、識別的有近500種。miRNA 存在多種形式，可分為原始miRNA（primiRNA）、miRNA 前 體（pre-miRNA）和成熟miRNA（mtmiRNA）共3類。miRNA 的初級轉錄物通常由細胞核內的RNA 多聚酶Ⅱ（Pol Ⅱ）轉錄成pri-miRNA，然后由RNase III 內切酶Drosha 在核內加工成pre-miRNA，并從核內導入胞質，再經RNase III 內切酶Dicer 加工成為單鏈mt-miRNA[8,16,17]。mtmiRNA主要有以下特 點[17～20]：（1）分布廣泛和功能多樣。miRNA 廣泛分布于真核細胞內，參與多種調節(jié)途徑，在生物體發(fā)育、器官形成、造血、病毒防御以及細胞的增殖、凋亡和惡變等方面發(fā)揮重要的調控作用。（2）位于基因組非編碼區(qū)。編碼miRNA 的基因可能位于編碼基因的內含子區(qū)、基因間隔區(qū)，或非編碼基因的外顯子區(qū)和內含子區(qū)，絕大部分則位于基因間隔區(qū)。70%哺乳動物的miRNA 基因位于TUs 區(qū)，通常長度為18～25 nt。（3）多數miRNA 以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在。（4）大都具有發(fā)夾結構。5’-端有磷酸基，3’-端為羥基，二者可與上游或下游序列不完全配對形成發(fā)夾結構，這一特點使它與大多數寡核苷酸和功能RNA 的降解片段區(qū)別開來。（5）一些內含子miRNA 基因具有高度保守性。體現在基因位置上的保守性和序列上的高度同源性。（6）在表達上具有階段性和組織特異性。在生物發(fā)育的不同階段有不同的miRNA 表達，在不同的組織中表達量也不同。（7）在轉錄水平直接對靶基因進行調控。每個miRNA 可調控多個靶基因，而某個特定靶基因也可同時被多個miRNAs 調節(jié)。

RNA 介導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）是生物體內一種廣泛使用的基因表達調節(jié)機制。上述過程產生的mt-miRNA 被酶切成短的雙鏈配對分子（miRNA/miRNA），隨后其中的一條鏈被裝載在RISC 的核心成分AGO蛋白上形成復合物RISC，并通過與靶基因mRNA（tg-mRNA）序列的3’-UTR 區(qū)互補配對的方式識別tg-mRNA[8,20]。RISC 對tg-mRNA 的作用取決于它與靶基因轉錄體序列互補的程度，互補配對高時可能進行切割，互補配對低時則起抑制翻譯作用[20]，大致有3種方式：（1）直接切割。即 在miRNA 與tgmRNA 完全互補時，AGO 蛋白可通過此種方式發(fā)揮降解tgmRNA 的作用。（2）抑制翻譯。如果miRNA 與tg-mRNA 不能完全互補，AGO 蛋白則可阻遏tg-mRNA 的翻譯而不影響其穩(wěn)定性。（3）結合抑制。即具有以上兩種作用模式，導致翻譯活躍的核糖體裂解，或通過未知因子阻遏tg-mRNA 的翻譯。

2.2 miRNAs 在肝纖維化中對TGF-β/Smad 信號通路的調控作用

越來越多的證據表明，miRNAs 參與肝纖維化過程，部分調控TGF-β/Smad 信號通路的成員，已成為調節(jié)TGFβ信號和肝纖維化發(fā)生的關鍵調控因子，但miRNA 對TGFβ 受體I（TβRI）產生的調控作用仍不清楚[4,13,21]。目前研究發(fā)現調節(jié)肝纖維化TGF-β/Smad 信號通路的主要miRNAs 包括miR-19b、miR-33a、miR-200a、miR-146a、miR-17-5p、miR-101、miR-29b、miR-30c、miR-30、miR-193、miR-21、miR-454、miR-155、miR-130a/b、miR-214、miR-let-7、miR-31、miR-133a 和miR-375-3p等。它們可通過調控TGF-β/Smad 通路中的相關因子、蛋白或靶基因來影響信號轉導過程，從而調控HSCs 的增殖、活化與凋亡，進而調節(jié)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。以下依序對上述miRNAs 的作用進行簡要闡述：

Lakner 等[22]、Zhang 等[23]通過體外培養(yǎng)大鼠靜息和活化的HSCs，發(fā)現激活的HSCs 中miR-19b 顯著減少，同時TβRⅡ顯著上調；然后將活化的HSCs 中miR-19b 的水平提高，發(fā)現TβRⅡ水平明顯降低，Smad3的mRNA 表達顯著下調，同時抑制了細胞中α-SMA 和膠原蛋白的表達，說明miR-19b 可通過調節(jié)TβRⅡ和Smad3的表達水平影響膠原蛋白的表達，即通過降低TβRⅡ和Smad3的表達量來減弱膠原的生成。

Huang 等[24]研究發(fā)現，miR-33a 在肝組織中的表達水平與肝纖維化的進展呈正相關，HSCs 中miR-33a 的表達明顯高于其他肝纖維化相關細胞，可能是通過調節(jié)Smad7表達的潛在機制來調節(jié)TGF-β的活化，并認為miR-33a 可能是HSCs 活化和肝纖維化進展的新標志物。

Sun 等[25]研究發(fā)現miR-200a 在TGF-β1誘導的活化HSC中和體外CCl4誘導的大鼠肝纖維化中的表達均降低，而miR-200a 的過表達顯著抑制HSCs 中α-SMA 的活性。此外，miR-200a 還可通過調控Wnt/β-catenin 通路來延緩或阻止肝纖維化的發(fā)生。高表達的miR-200a 可通過作用于TGF-β通路來抑制HSCs 的活化和α-SMA 的活性，減少ECM 的生成和沉積，進而抑制肝纖維化的發(fā)生和進展。

He 等[26]研究發(fā)現，在TGF-β1刺激下活化的HSCs 中以及在肝纖維化組織中的miR-146a 表達水平下調；在提升miR-146a 的表達后，則發(fā)現TGF-β1誘導的HSCs 活化被抑制。經分析預測Smad4是miR-146a 的潛在靶點，miR-146a 通過抑制Smad4的表達參與調控TGF-β1誘導的HSCs 的增殖與活化，進而抑制了肝纖維化的發(fā)展。這些結果提示miR-146a 靶向作用于Smad4阻斷TGF-β的信號轉導，可能作為一種新的調節(jié)因子調節(jié)HSCs 的活化。

Yu 等[27]研究證明，Smad7是miR-17-5p 的直接作用靶點，miR-17-5p 至少部分通過降低Smad7而減弱其在TGF-β/Smad信號通路中的反饋抑制作用，導致HSCs 的增殖和活化，進而使Ⅰ型膠原和α-SMA 的表達增加，由此促進肝纖維化的進程。

Tu 等[13]在CCl4誘導肝纖維化小鼠的研究中，觀察到活化的HSCs 和纖維化的肝中miRNA-101顯著下調，肝纖維化中TβRI 以及它的轉錄激活因子Kruppel（KFL6）均出現上調。隨后提高小鼠HSCs 中miR-101的水平，發(fā)現HSCs 中的TβRI 和KLF6的表達顯著降低，證明TβRI 和KLF6是miRNA-101的直接靶點，miR-101可通過抑制TβRI 以及KLF6的上調抑制HSCs 中TGF-β信號轉導，進而抑制肝纖維化的發(fā)展。最近的研究發(fā)現，Schisandrin B（五味子乙素）可上調HSC-T6細胞和CCl4處理大鼠體內miR-101-5p 的表達，通過調節(jié)TGF-β信號途徑來減輕肝纖維化[28]。

Wang 等[29]研究發(fā)現，miR-29b 與TGF-β介導的纖維化有關，其表達在人和小鼠的肝組織中及活化的HSCs 中是下調的，其下調由Smad3直接介導，同時miR-29b 又可以抑制Smad3的表達。Liang 等[30]也證實miR-29b 與TGF-β1/Smad3信號通路之間相互作用，表明miR-29b 抑制Smad3和TGF-β1介導的肝星狀細胞LX-2的激活，從而抑制肝纖維化。

Roy 等[31]發(fā)現CCl4誘導肝纖維化小鼠和分離培養(yǎng)的HSCs 中miR-30c 和miR-193出現一致下調；當TGF-β作為刺激因子時，miR-30c 和miR-193發(fā)生顯著下調；之后選擇TGF-β信號通路中的兩個調控ECM 生成的關鍵因子Snail-1和TGF-β2分別作為miR-30c 和miR-193的作用靶點進行驗證，發(fā)現CCl4誘導的肝纖維化小鼠中Snail-1和TGF-β2上調，且在小鼠的HSCs 中過表達miR-30c 時Snail-1顯著減少，而過表達miR-193時TGF-β2下調，膠原蛋白的表達降低，這些結果表明在肝纖維化過程中miR-30c 和miR-193的下調可能受TGF-β的調節(jié)，且二者可通過下調Snail-1和TGF-β2使ECM 的生成減少，進而抑制肝纖維化。也有研究發(fā)現，miR-30通過抑制KLF11的表達以減弱HSCs 活化過程中TGF-β/Smad7信號通路的傳導，達到增強Smad7的負反饋調節(jié)，抑制HSCs 的增殖和遷移，從而抑制CCl4誘導的肝纖維化的目的[32]。

Noetel 等[33]發(fā)現，miR-21在TGF-β刺激后可下調Smad7的表達，并通過上調Smad3而不是Smad2的轉錄活性，從而減弱Smad7對TGF-β信號通路的負調控作用，促進肝纖維化。隨后，Tu 等[34]發(fā)現，小鼠肝細胞中的lincRNA-p21作為TGF-β信號的下游效應器，可通過與miR-30相互作用而加強TGF-β信號，并介導其促進肝纖維化的作用。新的研究發(fā)現，miR-21的過表達通過抑制SPRY2和Smad7的表達，顯著激活ERK 和TGF-β1/Smads 通路[35]。但最新的觀點也認為，miR-21對HSCs的活化和肝纖維化的發(fā)生并不重要[36]。

此外，Zhu 等[37]研究發(fā)現，miR-454在TGF-β1處理的LX-2細胞中表達下調，并可通過直接靶向Smad4抑制HSCs 的活化。Csak 等[38]發(fā)現，miR-155可減弱TGF-β 信號轉導蛋白Smad3的表達，從而影響肝纖維化過程。Lu 等[39]研究發(fā)現，TGF-β1可能介導HSCs 細胞培養(yǎng)中miR-130a 和miR-130b 的過度表達、PPARγ的下調和ECM 基因的過度表達，達到影響肝纖維化的作用。Okada 等[40]認為，miR-214的強誘導作用與慢性乙型或丙型肝炎患者的肝纖維化有關，可能通過調節(jié)EGFR和TGF-β信號通路參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。Matsuura 等[41]研究發(fā)現，低水平的miR-let-7可能通過激活HSCs 中的TGF-β信號通路影響肝纖維化的發(fā)生。Hu 等[42]發(fā)現，過度表達的miR-31通過增強MMP-2的表達來促進HSC 的活化和遷移，這可能是通過靶向缺氧誘導因子（HIF-1）的抑制因子FIH1來實現；同時發(fā)現TGF-β能顯著增加原代大鼠HSCs 中miR-31的表達，且Smad3可通過直接與miR-31的啟動子結合以刺激miR-31的轉錄活性。這些證據表明，miR-31/FIH1通路可能通過參與HSCs 的TGF-β/Smad3信號傳導而達到調控肝纖維化的目的。Roderburg 等[43]研究發(fā)現，miR-133a 在纖維化過程中的HSCs 內明顯下調，在以TGF-β處理的原發(fā)性小鼠和人的HSCs中miR-133a 的表達顯著下調，且miR-133a 在原代小鼠HSCs中的過度表達可導致膠原的表達減少。Yang 等[44]最新發(fā)現，在用miR-375-3p 模擬物處理的BRL-3A 細胞和/或原代大鼠肝細胞中，miR-375-3p 的低表達可誘導JAK2/STAT3途徑激活TGF-β1/Smad 信號，從而促進EMT，這與過量攝入果糖導致的肝纖維化相關。

3 結語

研究人員為抑制或預防肝纖維化的發(fā)展付出了努力。阻止HSCs 的活化以及阻礙肝纖維化相關的信號通路已成為抑制肝纖維化的目標。本文闡述了TGF-β/Smad 信號轉導通路在肝纖維化發(fā)展中的機制，總結了之前肝纖維化中有關miRNAs 的研究結果，歸納了迄今已發(fā)現的大部分相關miRNAs 對于TGF-β/Smad 信號通路的調節(jié)機制。不難想象，不久的將來可通過靶向調控相關miRNAs 的表達來進行抗纖維化治療。除了可用于治療外，與肝纖維化相關的miRNAs還可作為疾病診斷和監(jiān)測預后的標志物，而且這些miRNAs也有可能成為針對肝纖維化的有用生物標志物或新型治療制劑。