郝曉龍，王斌全

(1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，山西 太原 030001； 2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，山西 太原 030001)

喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一,占全身惡性腫瘤的1%～5%、96%～98%為喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)[1]。2018年全球新發(fā)喉癌177 422例(1.0%),死亡94 771例(1.0%)[2]。腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)最早由Klein于1976年報道，主要成分為腫瘤浸潤T淋巴細胞，隨后的研究顯示TILs與多種實體腫瘤(包括LSCC)的進展相關，其浸潤程度與患者預后相關[3]。本文就TILs一般特征、TILs評估方法及腫瘤浸潤T淋巴細胞對LSCC的預后評估價值進行綜述。

1 TILs一般特征

TILs是指浸潤在腫瘤組織中的淋巴細胞群，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，由幾種不同的淋巴細胞亞群組成，包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞、NK細胞和NKT細胞等。TILs在腫瘤的清除、平衡和逃逸3個階段中有至關重要的作用。LSCC中的TILs能產(chǎn)生包括細胞因子、趨化因子和生長因子等小分子，這些因子可以促進抗原提呈，殺傷腫瘤細胞，從而參與腫瘤細胞識別與清除，也可以促進癌變，并協(xié)助腫瘤侵襲和轉移[4]。此外，鱗狀細胞癌本身也可以過表達，具有促炎、促血管生成和免疫調節(jié)活性的細胞因子，介導免疫耐受，造成免疫逃逸。腫瘤細胞和TILs之間的相互作用不僅影響疾病的發(fā)生和發(fā)展，而且與患者預后密切相關[5]。

2 TILs評估方法

TILs的評估最早在19世紀80年代被開發(fā)出來，Wolf等[6]使用特定T細胞的單克隆抗體對頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell cancer,HNSCC)特定淋巴細胞亞群進行了研究。組織切片由丙酮固定，對腫瘤基質和腫瘤實質均進行了浸潤評估。對于每個淋巴細胞亞群，將基質或實質的浸潤程度記錄為每個高倍視野的平均細胞數(shù)。由于該項研究隨訪時間較短(平均9.5個月)，病例數(shù)較少(40例)且腫瘤部位異質性等原因，其結論與現(xiàn)今主流認識有所不同。Snyderman等[7]使用了基于流式細胞學的熒光激活細胞計數(shù)對26例HNSCC進行了分析，得出的結果與使用免疫組織學技術獲得的結果吻合，表明使用流式細胞學技術同樣可以對TILs進行有效的分離與分析。

國際腫瘤免疫學生物預測標記物工作組于2017年引入的最新指南已成為評估不同癌癥中TILs的一種簡單且經(jīng)濟高效的方法[8]。由于它在觀察者之間的高度共識，因此可以作為評估TILs的標準方法。它已被證明是具有良好重現(xiàn)性的不同HNSCC部位研究的有前景的預后工具[9-10]。提議的方法將診斷性HE染色的癌切片用于以百分比(5%、10%、20%、30%等)作為連續(xù)參數(shù)評估TILs。對TILs的評估在間質TILs和瘤內TILs中進行。 間質TILs是指淋巴細胞占據(jù)的間質區(qū)域的百分比；瘤內TILs是指浸潤的淋巴細胞占據(jù)的腫瘤部分的百分比。該指南未確定將腫瘤分層為低TILs或高TILs的臨界點。

最近的研究已廣泛使用人工智能和圖像分析技術來評估生存預測的預后標志物，Shaban等[11]一項關于口腔鱗狀細胞癌的研究描述了一種新穎的數(shù)字評分TILs abundance(TILAb)，用于評估HE染色玻片上的TILs。TILAb首先使用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(convolutional neural network,CNN)將整個玻片圖像分割為不同組織類型(腫瘤、淋巴細胞等)，然后通過淋巴細胞與腫瘤的比率及其共定位的組合來量化TILs。這樣的數(shù)字方法可以幫助快速、準確和標準化的TILs評估，但是其圖像分割性能及圖像處理速度仍有待提高[12]。

通過基于組織的方法對TILs進行表征受到一些因素的限制，如可以同時測定的細胞類型數(shù)量和所需的組織數(shù)量。應用于實體腫瘤的基因表達譜技術可以迅速地為TILs提供廣闊的視野。其中最著名的方法是基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，分析了多種癌癥類型的總體免疫及基質浸潤水平[13]。不同于 GSEA只能計算描述樣品中細胞類型富集的半定量得分，反卷積方法如CIBERSORT和DeconRNA-Seq等，可以定量估計特定細胞類型的相對分數(shù)[14-15]。轉錄組學分析只需要少量的RNA，可以進行順序分析以及研究腫瘤中的惡性細胞和TILs特性[16]。轉錄組學分析可以同時分析大量標記，并且通過測量趨化因子、細胞因子和炎性分子的基因表達，可以告知腫瘤與宿主相互作用的功能方向。此外，他們也能夠與其他分子分析結合，例如調用蛋白質組學與外顯子測序等分子亞組。轉錄組學分析能夠大大縮短測序的時間和費用，其主要缺點是通過基因特征表達對細胞群體進行定量分析而無法提供在腫瘤中相應細胞類型的分布信息。

高通量測序技術使得業(yè)界更加清晰地認識到腫瘤微環(huán)境中基因水平的差異。Galon等[17]通過高通量結腸癌腫瘤微環(huán)境數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，Th1獲得性免疫相關的基因與患者的術后復發(fā)存在明顯正相關。Galon等[18]隨后通過免疫組化技術，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織內TILs的數(shù)量、種類和區(qū)域對于預測臨床預后具有決定意義?；谶@些研究，Galon等[19]提出采用免疫評分來對結直腸癌患者進行打分，從而預測患者預后，并建立了一套標準的檢測流程和試劑要求。該方法根據(jù)腫瘤中心區(qū)域和腫瘤浸潤交界區(qū)域中CD3+和CD8+細胞的密度高低，得出免疫評分(0～4分)。免疫評分與傳統(tǒng)TILs評估方法相比，有成本低、周期短、自動化程度高、穩(wěn)定性和可重復性高以及生存周期預測性高等優(yōu)點。盡管免疫評分的預后預測價值已在結直腸癌、胃癌、乳腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中得到了驗證，其在其他惡性腫瘤中的預后預測仍有待驗證[20-24]。

3 腫瘤浸潤T淋巴細胞對LSCC的預后評估價值

3.1 TILs的總體評估

Alessandrini等[25]使用了基于2014年國際TILs工作組乳腺癌TILs評估指南的方法，對70例接受初級手術的早期和局部晚期LSCC患者進行了研究，發(fā)現(xiàn)TILs計數(shù)較高的患者比TILs計數(shù)較低的患者具有明顯更低的復發(fā)率(recurrence rate，RR)和更長的無病生存期(disease free survival，DFS)。與此類似，Vassilakopoulou等[26]和Wang等[27]也應用了國際TILs工作組乳腺癌TILs評估指南基于H&E的半定量TILs評估，兩項研究均發(fā)現(xiàn)基質TILs是LSCC患者總生存期(overall survival，OS)和DFS的獨立預后因素。

3.2 CD3+T細胞

CD3+是腫瘤浸潤T淋巴細胞的一個高度特異性標記物。在一個主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)分子的作用下，T細胞受體CD3+復合物通過其抗原結合，將激活信號轉導到T細胞的細胞質中。Nguyen等[28]發(fā)現(xiàn)LSCC患者TILs中CD3+的高表達有利于OS、局部無進展生存期(local progression free survival，LPFS)和遠處無轉移生存率(distant metastasis free survival，DMFS)。Le等[29]發(fā)現(xiàn)HNSCC患者CD3+T細胞高度浸潤的患者表現(xiàn)出更好的臨床結局，且缺氧相關標志物galectin-1和CD3+染色之間存在很強的逆相關性，提示低氧可以幫助腫瘤逃避免疫監(jiān)視從而影響患者預后。研究表明CD3+T細胞的預后價值取決于浸潤方式，Balermpas等[30]認為腫瘤內CD3+T細胞的高表達與較好的預后相關，而腫瘤基質或腫瘤周圍的CD3+高表達并不影響預后，而Zhou等[31]發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍高CD3+表達均與OS和DFS顯著相關，而瘤內區(qū)域CD3+T細胞浸潤的影響無統(tǒng)計學意義。這樣的差異可能是由于這兩項研究瘤內區(qū)域定義不同導致的。與結直腸癌等腺癌不同，Zhang等[32]研究了包含55例LSCC在內的HNSCC發(fā)現(xiàn)浸潤邊緣中CD3+T細胞的密度與預后無關，并因此認為LSCC的TILs評估應與腺癌不同。

3.3 CD8+T細胞

CD8+T淋巴細胞也稱為細胞毒性T細胞，由于其具有通過與人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)I類分子結合而直接靶向和破壞腫瘤細胞的能力，因此它是比CD3+更強健的生物標志物。高水平的腫瘤內CD8+T細胞可能與宿主對已通過環(huán)境致癌物作用轉化的癌細胞的反應有關[33]。Keck等[34]對一組包含29例喉癌的局部區(qū)域晚期HNSCC進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)CD8+TIL水平較高的患者可提高生存率并具有特定的基因特征稱作炎癥/間質亞型。Ogino等[35]對63例喉癌患者進行了CD8+T細胞浸潤的定量發(fā)現(xiàn)，CD8+T細胞浸潤的癌癥特異生存期(cancer-specific survival，CSS)明顯更長，但CD8+T細胞的浸潤程度與DFS之間無統(tǒng)計學意義的關聯(lián)。Hoesli等[36]研究顯示了CD8+T細胞在復發(fā)/持續(xù)喉癌患者中的獨立預后價值。Zhou等[31]發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞浸潤的密度與腫瘤分期、淋巴結分期和復發(fā)之間呈負相關。與此相反，Badoual等[37]在包含19例喉癌在內的84例HNSCC患者組織中沒有發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞浸潤與OS或無復發(fā)生存期(relapse-free survival，RFS)之間有關聯(lián)，并認為這一結果可能與CD8+T細胞對HNSCC細胞凋亡特別敏感有關。Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)，和CD3+T細胞一樣，CD8+T細胞在腫瘤中心的浸潤與患者良好預后相關，而浸潤邊緣的CD8+T細胞浸潤與預后無關。Spector等[38]發(fā)現(xiàn)在控制已知預后因素的多變量分析中，較高水平的CD8+與OS改善相關。Chatzopoulos等[39]發(fā)現(xiàn)在單變量分析中更高的CD8+T細胞浸潤水平與LSCC患者良好的OS相關而與DFS無關，無法在多變量分析中證明CD8+TILs的預后作用，因而不支持將CD8+T細胞作為患者評估的優(yōu)質工具。但是由于不同研究的多變量模型設置了不同的變量及分組，且一些研究的隊列包含了不同臨床病理特征的患者，這使得結果難以比較。

3.4 CD4+T細胞

CD4+T細胞是一系列具有不同功能的細胞群，T輔助細胞(T helper cell,Th)包括Th1、Th2、Th9、Th17、濾泡輔助T細胞和CD4+、CD25+調節(jié)性T細胞等。CD4+T細胞通過促進CD8+T細胞毒性T淋巴細胞的增殖來響應HLA II類蛋白質呈遞的抗原，從而產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應答，在不存在CD8+T細胞的情況下，CD4+T細胞可以通過直接裂解II類MHC陽性腫瘤細胞或促進其他效應細胞(如巨噬細胞和嗜酸性粒細胞)的募集來抑制腫瘤的生長[40-42]。Th1分泌I型細胞因子，例如γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，它們通過激活抗原呈遞細胞來刺激CD8+T細胞反應。 T輔助2型淋巴細胞(Th2)分泌II型細胞因子，例如白細胞介素(interleukin,IL) - 4，IL-5和IL-13，它們限制了抗原呈遞細胞的激活并增強了體液免疫。Th17細胞產(chǎn)生IL-17，能夠參與誘導和介導促炎癥反應，并對HNSCC的致癌作用及其轉移形成有實質性影響[43-44]。Curiel等[45]發(fā)現(xiàn)Treg細胞表達細胞內細胞毒T淋巴細胞相關抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen- 4, CTLA- 4)，糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid-induced tumor necrosis factorreceptor，GITR)和叉頭框轉錄因子P3 (forkhead box P3,FoxP3)，抑制腫瘤相關抗原特異性免疫，有助于腫瘤生長。目前FoxP3是可用于鑒定Treg細胞的最佳標記，但使用此標記可能會高估腫瘤內Treg細胞的頻率或密度，因為已知FoxP3還可以在其他類型的細胞中表達。Tanaka 等[46]認為Treg主要介導外周耐受，并有助于維持免疫穩(wěn)態(tài)，其產(chǎn)生抑制性細胞因子如IL-10、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和IL-35，抑制效應細胞反應。 在最早的研究中，Wolf等[6]認為，腫瘤實質中CD4+T細胞浸潤水平升高與更長的無病間隔(disease-free interval,DFI)和OS相關，而與實質浸潤相反，基質中低水平的CD4+T細胞與DFS有關。Badoual等[37]對含19例LSCC在內的84例HNSCC研究發(fā)現(xiàn)，高水平的腫瘤浸潤CD4+、CD69+T細胞與OS和RFS呈正相關，在單變量和多變量分析中，腫瘤浸潤性CD4+FoxP3+T細胞的水平與較好的RFS呈正相關。Nguyen等[28]研究了含48例LSCC在內的513例HNSCC，發(fā)現(xiàn)較高的CD4+TILs水平與OS和RFS的改善有關。在控制了預后因素后，較高的CD4+TILs水平可預測OS和疾病特異性生存期(disease-specific survival，DSS)的改善。Hoesli等[36]發(fā)現(xiàn)在復發(fā)/持續(xù)喉癌患者中CD4+TILs水平升高與DFS和DSS改善有關，Mann等[47]也得出了類似的結論。與這些研究不同，Sun等[48]在含23例喉癌在內的手術后復發(fā)頭頸惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)CD4+FoxP3+T細胞與不良的RFS相關。Balermpas等[30]在含4例喉癌在內的60例頭頸惡性腫瘤中沒有觀察到CD4+或FoxP3與其系列中的臨床結果有任何相關性。Zhang等[49]對60例LSCC患者進行了研究發(fā)現(xiàn)人乳頭狀瘤病毒陽性患者預后的改善與更少的CD4+TILs相關。

4 總結與展望

綜上所述，腫瘤浸潤T淋巴細胞可以作為LSCC預后評估指標，不同類別的腫瘤浸潤T淋巴細胞在LSCC中具有不同的預后價值。但是仍存在諸多問題使得腫瘤浸潤T淋巴細胞未能應用于臨床?，F(xiàn)有研究多為回顧性研究且病例數(shù)量有限，其結果受排除病例(如失訪、病理資料不足)影響較大，且只能從統(tǒng)計學角度來評估腫瘤浸潤T淋巴細胞與LSCC預后的相關性，并沒有研究各腫瘤浸潤T淋巴細胞亞群的功能測定，未來需要更多的前瞻性研究來進一步證實各腫瘤浸潤T淋巴細胞亞群功能及腫瘤浸潤T淋巴細胞的療效預測作用。此外，腫瘤浸潤T淋巴細胞的數(shù)量和功能本質上是動態(tài)的，最初在活檢標本中評估腫瘤浸潤T淋巴細胞后，后續(xù)治療(如放化療、免疫治療)可能會顯著改變浸潤狀態(tài)，標本原始的預后價值可能因此而被干擾。因此需要開發(fā)包括癌細胞和腫瘤浸潤T淋巴細胞免疫原性基礎的免疫指標，也可以通過多次活檢動態(tài)評估腫瘤浸潤T淋巴細胞。相信隨著研究的深入，腫瘤浸潤T淋巴細胞終將應用于臨床工作，成為更好的預后評估工具。