范佳俊，王君杰，陳烽，陳哲

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005)

脊髓損傷是脊柱損傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥，往往導(dǎo)致?lián)p傷平面以下自主運(yùn)動(dòng)和感覺的喪失[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全世界平均每年每百萬人中有40～80人發(fā)生脊髓損傷[2]，其中年輕人占比較大[3]。Edwin Smith早在公元前2500年就認(rèn)為該病是“不可治愈且不值得治療的”[4]。目前盡管各種治療手段較之前取得了一定進(jìn)展，但療效仍不能令人滿意，至今仍沒有一種普遍被接受且治療效果顯著的方法用來治療該病[5-6]。近年來，隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，尤其是干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，脊髓損傷的治療也有了新的方向。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)是由分化的體細(xì)胞經(jīng)過重編程而產(chǎn)生的多能干細(xì)胞，兼具干細(xì)胞的多種優(yōu)點(diǎn)，有著近似胚胎干細(xì)胞的自我更新能力和分化潛能。目前，IPSCs已成為國內(nèi)外干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本文就IPSCs治療脊髓損傷的研究進(jìn)展綜述如下。

1 脊髓損傷的概述

脊髓損傷可分為原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。原發(fā)性脊髓損傷是由外力直接引起的，通常導(dǎo)致神經(jīng)組織的變形、撕裂，甚至神經(jīng)軸被切斷，這些損傷往往是不可逆的。脊髓損傷后，短時(shí)間內(nèi)(幾分鐘)病變部位開始出血，引發(fā)血管痙攣、血栓形成以及脊髓水腫[7]?？梢?，脊髓損傷主要是神經(jīng)損傷和血管結(jié)構(gòu)損傷。在原發(fā)性脊髓損傷后，繼發(fā)性脊髓損傷開始出現(xiàn)，并將持續(xù)幾分鐘至幾個(gè)月不等[8]。脊髓損傷后脊髓組織出現(xiàn)水腫，血腦脊髓屏障會(huì)被破壞，隨后內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變性，神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕增生[9]。膠質(zhì)瘢痕增生在脊髓損傷后3 d開始，并在約28 d后達(dá)到穩(wěn)定[10]。最終，脊髓受損區(qū)域內(nèi)軸突再生的過程會(huì)被提前增生的膠質(zhì)瘢痕阻斷。硫酸軟骨素蛋白多糖是一種與膠質(zhì)瘢痕增生相關(guān)的神經(jīng)軸突生長抑制分子，也參與了抑制病變區(qū)脊髓的再生[11]。

2 IPSCs的產(chǎn)生和生物學(xué)特性

治療脊髓損傷的重點(diǎn)在于修復(fù)、重建損傷的脊髓，以及恢復(fù)運(yùn)動(dòng)、感覺和自主神經(jīng)功能[12]。神經(jīng)元是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的關(guān)鍵細(xì)胞，它能啟動(dòng)新的軸突生長，并最終建立新的突觸連接[13]。軸突的再生需要5個(gè)步驟：第1步，從損傷區(qū)進(jìn)行逆行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；第2步，將信號(hào)輸入細(xì)胞核；第3步，軸突生長必不可少的分子轉(zhuǎn)錄和翻譯；第4步，軸突自身生長；第5步，軸突突觸形成[14]。干細(xì)胞移植可以為受損區(qū)域提供充足的外源性神經(jīng)元，建立脊髓再生的基礎(chǔ)條件，這為脊髓損傷的治療開啟了新的篇章。神經(jīng)干/祖細(xì)胞(neural stem/progenitor cells，NS/PCs)已被證明是所有候選細(xì)胞中較為理想的供體細(xì)胞[15]。獲取NS/PCs的經(jīng)典方法是使用胚胎干細(xì)胞。由胚胎干細(xì)胞衍生分化而來的NS/PCs具有修復(fù)受損脊髓，促進(jìn)脊髓損傷模型動(dòng)物功能恢復(fù)的能力[16]。然而，源自人的胚胎組織或胚胎干細(xì)胞因涉及倫理問題而受到限制，甚至在某些國家已經(jīng)明確表示禁止使用[17]。為了解決無法使用胚胎組織的這個(gè)問題，Yamanaka將Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc這4種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染到小鼠體細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠的體細(xì)胞經(jīng)過這4種因子的誘導(dǎo)后產(chǎn)生了逆分化現(xiàn)象，形成了多能干細(xì)胞，即為IPSCs[18]。這些誘導(dǎo)生成的多能干細(xì)胞顯示出與胚胎干細(xì)胞相似的特性，同樣具有多重分化能力。干細(xì)胞經(jīng)歷分化后，基因被選擇性表達(dá)，形成具有特定功能的體細(xì)胞，但這些細(xì)胞本質(zhì)上并沒有改變自身遺傳物質(zhì)。IPSCs的制備過程就是將分化的細(xì)胞在特定條件下逆轉(zhuǎn)，使之擁有無限生長的能力，同時(shí)又保持多能性。IPSCs在形態(tài)、蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體及畸形瘤生成、分化能力等方面均與胚胎干細(xì)胞相似。IPSCs能分化為所有胚層細(xì)胞，分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官。這種源自體細(xì)胞的IPSCs不僅解決了倫理問題，而且若細(xì)胞來源于患者自身，在臨床使用過程中還可以避免免疫排斥的問題。

3 IPSCs移植治療脊髓損傷的研究現(xiàn)狀

目前，越來越多的研究團(tuán)隊(duì)將IPSCs應(yīng)用于脊髓損傷的治療，并證明了其有效性。Tsuji等[19]用小鼠IPSCs引導(dǎo)分化后形成神經(jīng)球，并將神經(jīng)球移植到脊髓被挫傷9 d后的小鼠脊髓損傷區(qū)，結(jié)果顯示這些源自IPSCs的神經(jīng)球成功地分化為3個(gè)細(xì)胞譜系，即神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)了小鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。Nori等[20]將成年人成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞來建立人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human-induced pluripotent stem cells，HIPSCs)，并將這些HIPSCs衍生的神經(jīng)球移植到非肥胖型糖尿病聯(lián)合嚴(yán)重免疫缺陷的小鼠脊髓中治療脊髓損傷，結(jié)果顯示HIPSCs衍生的神經(jīng)元和受損區(qū)域中的小鼠神經(jīng)元之間形成了突觸連接，而且直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(脊髓損傷后112 d)仍可以觀察到小鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。Kobayashi等[21]通過使用HIPSC-NS/PCs來治療狨猴脊髓損傷，結(jié)果證明了IPSCs在靈長類動(dòng)物脊髓損傷模型中同樣有效，這使得人們更加相信IPSCs未來可以用于治療人類的脊髓損傷。Fujimoto等[22]的研究表明，實(shí)驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)是由被移植的神經(jīng)元和存活的內(nèi)源性神經(jīng)元共同參與完成的，2種類型的神經(jīng)元均通過形成突觸連接并整合神經(jīng)元回路來重建皮質(zhì)脊髓束。

由于脊髓損傷分為急性損傷和慢性損傷，所以并不是所有的研究在將IPSCs用于治療脊髓損傷時(shí)都能取得令人滿意的結(jié)果。我們查閱了近10年來所有關(guān)于HIPSCs移植治療脊髓損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，其中近90%的實(shí)驗(yàn)研究是在脊髓損傷的急性或亞急性期，即脊髓損傷后14 d內(nèi)移植了HIPSCs。但是否在脊髓損傷的急性期移植HIPSCs就一定有效，目前尚存爭(zhēng)議。Nutt等[23]從一位86歲的男性身上取體細(xì)胞建立了HIPSCs，在實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓損傷后第14天將其移植到免疫缺陷的脊髓損傷大鼠體內(nèi)，并通過組織學(xué)觀察，從受傷區(qū)域的白質(zhì)及灰質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了新生的軸突。Lu等[24-27]報(bào)道，在脊髓損傷的慢性期(脊髓損傷4周后)使用HIPSCs進(jìn)行細(xì)胞移植治療，組織學(xué)結(jié)果均顯示脊髓內(nèi)有新的軸突形成。盡管組織學(xué)結(jié)果令人滿意，但研究人員并未觀察到受傷大鼠的神經(jīng)功能有任何恢復(fù)。Lu等[24-25]報(bào)道，將HIPSCs移植到脊髓損傷大鼠體內(nèi)后，并沒有觀察到大鼠下肢功能的顯著改善。Okubo等[26-27]的研究結(jié)果顯示，雖然HIPSCs移植治療的時(shí)間間隔是最長的(脊髓損傷后42 d)，但均觀察到大鼠下肢神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能明顯得到改善。Yousefifard等[28-29]薈萃分析結(jié)果顯示，IPSCs移植治療可以改善脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，脊髓損傷后治療間隔時(shí)間越短后期功能恢復(fù)越好。

此外，有學(xué)者考慮將手術(shù)中極易獲得的椎間盤細(xì)胞作為IPSCs的供體細(xì)胞。Oh等[30]研究報(bào)道，在小鼠脊髓損傷后9 d，將來自椎間盤組織的IPSC-NS/PCs移植到小鼠脊髓中，結(jié)果顯示小鼠的后肢功能得到明顯改善。這說明椎間盤這種以前一直被認(rèn)為在手術(shù)中切除后只能被丟棄的組織，有望成為脊髓損傷替代療法的自體細(xì)胞來源。

4 IPSCs移植治療脊髓損傷面臨的問題及解決方法

4.1 免疫排斥問題及解決方法免疫排斥問題是IPSCs移植治療脊髓損傷的首要安全問題。自體細(xì)胞被誘導(dǎo)生成IPSCs并達(dá)到移植條件所需時(shí)間至少6個(gè)月[17]，這將錯(cuò)過脊髓損傷治療的最佳時(shí)期。因此，使用已生成和測(cè)試過的臨床特征良好的同種異體IPSCs則更可行。但是，使用同種異體IPSCs移植治療脊髓損傷，必然會(huì)產(chǎn)生免疫排斥問題。

Pomeshchik等[31]報(bào)道，對(duì)脊髓損傷實(shí)驗(yàn)大鼠僅給予他克莫司作為免疫抑制藥物，不僅遠(yuǎn)期生存率較差，而且大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)也未得到任何改善。而Romanyuk等[32]報(bào)道，將HIPSC-NS/PCs移植到脊髓損傷大鼠體內(nèi)后，給予環(huán)孢素、甲基潑尼松龍和硫唑嘌呤鈉等多種免疫抑制藥物，最終有大鼠存活了下來，且移植的細(xì)胞最終分化為中間神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。綜上，我們認(rèn)為IPSCs可以在免疫抑制的病變區(qū)域內(nèi)存活并發(fā)揮作用，但應(yīng)當(dāng)服用合適的免疫抑制藥物。

4.2 長期安全性問題及解決方法IPSCs移植治療脊髓損傷的長期安全性是另一個(gè)值得考慮的問題。Nori等[33]報(bào)道，在成人真皮成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Oct4、Sox2和Klf4因子，建立IPSCs細(xì)胞系并將之誘導(dǎo)形成神經(jīng)球后植入脊髓損傷小鼠體內(nèi)，這些神經(jīng)球最終分化為3種譜系的神經(jīng)細(xì)胞，在移植47 d后可見小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)；然而，到移植103 d時(shí)，由于移植區(qū)出現(xiàn)了腫瘤，最終導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)功能惡化。IPSCs移植治療脊髓損傷面臨的長期安全性問題是IPSCs有致瘤性。因此，我們認(rèn)為在采用IPSCs移植治療各種疾病之前，需要建立高度安全可信的IPSCs。IPSCs導(dǎo)致的腫瘤大致可以分為2種類型：一種是畸胎瘤，成熟畸胎瘤通常是一種良性疾病，它由多種不同的組織如皮膚、毛發(fā)、牙齒、骨骼、油脂和神經(jīng)組織等組成；另一種是實(shí)質(zhì)性腫瘤，極有可能向惡性發(fā)展，向外周侵襲甚至轉(zhuǎn)移[34]。

目前，畸胎瘤的形成機(jī)理尚未完全明確。近些年的研究表明，未分化的IPSCs仍是導(dǎo)致畸胎瘤形成的原因[35-36]。未分化的IPSCs具有與腫瘤細(xì)胞一樣的不受限制的分化能力，通過改變MHC-1、Fas或Trail突變來逃避免疫反應(yīng)，使其可以在宿主中不受限制的分化，從而形成畸胎瘤[37]。Okubo等[35]研究發(fā)現(xiàn)，使用γ-分泌酶抑制劑(gamma-secretase inhibitor，GSI)阻斷Notch信號(hào)通路，可以誘導(dǎo)未分化的HIPSC-NS/PCs在體外分化為成熟的神經(jīng)元細(xì)胞；通過基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，GSI能促使神經(jīng)元成熟的標(biāo)記基因上調(diào)，而與細(xì)胞繁殖和自我更新相關(guān)的基因標(biāo)記物下調(diào)；通過組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GSI處理的脊髓損傷區(qū)域中有成熟的分化神經(jīng)元，而未經(jīng)GSI處理的脊髓損傷區(qū)域中細(xì)胞呈腫瘤樣過度生長。因此，去除未分化細(xì)胞及降低細(xì)胞增殖能力可能是防止畸胎瘤形成有效手段?；チ龅男纬蛇€與供體細(xì)胞的組織來源有關(guān)。Miura等[38]報(bào)道，用成人不同組織生成的IPSCs進(jìn)行移植，發(fā)現(xiàn)畸胎瘤的形成傾向有很大差異；來源于胃上皮細(xì)胞的IPSC-NPCs沒有腫瘤形成傾向，而來自成年小鼠尾尖成纖維細(xì)胞的IPSCs具有較高的腫瘤形成風(fēng)險(xiǎn)。這表明IPSCs的供體組織不同，其移植后畸胎瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)也不同。

但是，有研究[33-34]發(fā)現(xiàn)，即使清除了所有未分化的細(xì)胞，在移植區(qū)域仍能發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性腫瘤。因此，闡明這些腫瘤的發(fā)生機(jī)制就顯得更加重要。與良性畸胎瘤相比，實(shí)質(zhì)性腫瘤通常是惡性的，它們有隨時(shí)侵襲或擴(kuò)散到身體其他部位的可能。這些腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制包括基因組不穩(wěn)定性和表觀遺傳不穩(wěn)定性[39-40]。引起基因組不穩(wěn)定的因素有3個(gè)方面原因：第一，IPSCs形成時(shí)使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒等整合載體。這些載體可以很容易將目的基因整合到細(xì)胞原有的基因組中，但這種整合是非定向的，這也就造成了在整合過程中可能會(huì)破壞細(xì)胞正常的抑癌基因并形成腫瘤[41-44]。使用GSI預(yù)處理移植細(xì)胞并使用非整合型仙臺(tái)病毒載體，可降低HIPSCs衍生細(xì)胞的腫瘤形成率，并提高HIPSCs衍生細(xì)胞移植治療的安全性[44-45]。因此，我們建議使用不干擾基因組的無整合方法轉(zhuǎn)染重編程因子，以避免因基因整合引起的致瘤性。第二，Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc這4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在各種自然形成的癌癥細(xì)胞中也會(huì)高表達(dá)。有報(bào)道表明，在40種癌癥類型中有18種癌癥細(xì)胞至少過表達(dá)一個(gè)重編程基因[46]。第三，成熟的體細(xì)胞經(jīng)歷多次分裂并存活很長一段時(shí)間才能獲得遺傳突變。在正常情況下，由于不再繁殖復(fù)制，這些突變對(duì)腫瘤形成的影響微乎其微。但是，如果細(xì)胞處在不斷的分裂繁殖期，這種微小的突變就會(huì)因?yàn)槎啻螐?fù)制而被放大，就可能會(huì)促使腫瘤形成[47]。除了基因組的不穩(wěn)定性外，表觀遺傳不穩(wěn)定性在腫瘤發(fā)生中也起著重要作用，尤其是DNA甲基化。Iida等[34]報(bào)道，癌基因甲基化不足的IPSC-NS/PCs更容易形成腫瘤。

5 小 結(jié)

IPSCs作為一種理想型的來源細(xì)胞，為未來應(yīng)用于臨床治療脊髓損傷帶來了希望，但是臨床應(yīng)用時(shí)仍需克服一些問題。首先，要考慮的是腫瘤的形成。通過IPSCs的終末分化，使用無基因整合方法以及建立可靠的移植細(xì)胞克隆來降低腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[48]。還可以利用自殺基因，特異性地去除移植區(qū)內(nèi)尚未分化的增殖細(xì)胞來降低腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；但是，自殺基因在去除這些細(xì)胞后還會(huì)影響已經(jīng)具有運(yùn)動(dòng)功能的細(xì)胞，這會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。其次，免疫抑制劑的使用仍是現(xiàn)階段乃至未來建立短時(shí)間內(nèi)獲取安全可靠的自體IPSCs方法之前，解決免疫排斥問題的優(yōu)選方案。未來的研究應(yīng)更加集中于慢性脊髓損傷的治療，為IPSCs移植治療脊髓損傷打通最后的難關(guān)。相信隨著學(xué)者們對(duì)IPSCs認(rèn)識(shí)及在移植調(diào)控方面研究的不斷深入，IPSCs在脊髓損傷修復(fù)中的應(yīng)用前景將更加廣闊。