陶雪蓉 曹東慧 黃園園 姜晶

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床研究部，長(zhǎng)春 130021；2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科門(mén)診部，長(zhǎng)春 130021

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）具有高度傳染性，其引起的新型冠狀病毒肺炎（以下簡(jiǎn)稱(chēng)新冠肺炎）已在全球范圍內(nèi)傳播[1]。目前新冠肺炎的感染和死亡人數(shù)仍在持續(xù)增加[2]，因此采取快速準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，及時(shí)采取隔離措施，早診斷、早治療，對(duì)于該病的管理及控制具有重要意義[3-4]。噬菌體展示技術(shù)作為抗體篩選工具具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)， 已在多個(gè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。本文將對(duì)噬菌體展示技術(shù)在SARS-CoV-2 檢測(cè)及新冠肺炎防治中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行重點(diǎn)介紹， 為開(kāi)發(fā)新型檢測(cè)與治療試劑、優(yōu)化方法等方面提供研究思路。

一、SARS-CoV-2 常用檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是目前使用最普遍的SARS-CoV-2檢測(cè)方法，但其操作較繁瑣，需要特定儀器設(shè)備且耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)樣本的采集、保存檢測(cè)條件等要求較高[4]，另外對(duì)病毒載量低的患者，檢測(cè)結(jié)果存在假陰性的問(wèn)題，因此還需開(kāi)發(fā)靈敏度更高的檢測(cè)方法。 免疫學(xué)檢測(cè)對(duì)樣本制備要求較低，檢測(cè)時(shí)間短，其中膠體金免疫層析法在15 min 左右即可肉眼觀察到顯色結(jié)果，無(wú)需特定儀器，操作簡(jiǎn)便[5]，但抗體產(chǎn)生較晚，檢測(cè)存在窗口期易造成假陰性。

抗原檢測(cè)與核酸檢測(cè)一樣可用于早期病毒感染檢測(cè)。 側(cè)向流動(dòng)技術(shù)是目前建立SARS-CoV-2 快速抗原檢測(cè)的常用方法，無(wú)需特定儀器且陽(yáng)性結(jié)果最快在5 min 內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)[6]，但不同的檢測(cè)研究數(shù)據(jù)顯示抗原檢測(cè)產(chǎn)品靈敏度變化較大[7]，因此抗原檢測(cè)需制備更高質(zhì)量的抗體，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

二、噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)將編碼外源多肽或蛋白的基因序列插入到噬菌體外殼蛋白基因中，使其以融合蛋白的形式展示在噬菌體外殼蛋白表面，并且可保持良好的生物活性及原有的生物功能，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合，這項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和藥理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域中，在病原檢測(cè)、疾病治療、疫苗或藥物設(shè)計(jì)等方面具有重要價(jià)值[8-9]。

1.噬菌體展示系統(tǒng)

目前，已開(kāi)發(fā)的噬菌體展示系統(tǒng)中單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)（PⅢ和PⅧ蛋白）較為常用。 PⅢ展示系統(tǒng)對(duì)插入的片段大小無(wú)嚴(yán)格限制，但拷貝數(shù)少，每個(gè)噬菌體表面與PⅢ融合展示的蛋白數(shù)限于5 個(gè)，因此常用于篩選高親和力配體或構(gòu)建文庫(kù)表達(dá)抗體等。 PⅧ展示系統(tǒng)拷貝數(shù)高，可以與PⅧ融合展示的蛋白數(shù)較多， 因此可誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫學(xué)應(yīng)答，用于免疫學(xué)研究或研制疫苗等[10]。

2.噬菌體展示文庫(kù)

噬菌體展示文庫(kù)中可包含數(shù)以?xún)|計(jì)的展示外源多肽或蛋白的噬菌體。 常用的噬菌體文庫(kù)包括隨機(jī)肽庫(kù)和抗體庫(kù)。噬菌體抗體庫(kù)有免疫或非免疫抗體庫(kù)[11]，并且可采用的抗體片段形式較多，包括單鏈可變區(qū)片段scFv，抗原結(jié)合Fab 段，雙價(jià)抗體片段或重鏈抗體片段等[12]，可來(lái)自人類(lèi)或羊駝和雞等動(dòng)物[13]。 噬菌體抗體庫(kù)中包含數(shù)以?xún)|計(jì)的抗體變體適合于高通量測(cè)定，并且在篩選過(guò)程中，通過(guò)幾輪的結(jié)合、洗脫與擴(kuò)增，使與靶分子高度特異性結(jié)合的噬菌體高度富集，得到高親和力的抗體，用于病毒檢測(cè)[14-15]。 早在 2005 年，Liu 等[16]就利用人單鏈抗體噬菌體庫(kù)篩選鑒定出可高特異性結(jié)合SARS 病毒的新型scFv，為其檢測(cè)試劑、疫苗和藥物的開(kāi)發(fā)提供了思路。

三、噬菌體展示技術(shù)在SARS-CoV-2 檢測(cè)中的應(yīng)用

制備與SARS-CoV-2 特異性結(jié)合的抗體， 是開(kāi)發(fā)抗原檢測(cè)產(chǎn)品的關(guān)鍵。 噬菌體展示技術(shù)作為抗體篩選的強(qiáng)大工具，具有通量高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，為抗體試劑的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。 最初，Parray 等[17]利用人源半合成噬菌體庫(kù)（TomlinsonⅠ）靶向SARS-CoV-2 的受體結(jié)合域（RBD）篩選抗體，鑒定出高親和力的scFv-Ⅱ62， 將其進(jìn)一步設(shè)計(jì)成scFv-Fc 和 IgG1形式，三種形式均顯示出對(duì)RBD 的高結(jié)合力，這些抗體為開(kāi)發(fā)基于抗體的檢測(cè)試劑奠定基礎(chǔ)，但目前研究多以更為保守的N 蛋白為靶標(biāo)對(duì)噬菌體庫(kù)進(jìn)行篩選[18]。

噬菌體展示技術(shù)與傳統(tǒng)抗體制備技術(shù)相比，能在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)更多結(jié)合不同表位的抗體。 為了特異性檢測(cè)抗原蛋白，有研究通過(guò)噬菌體展示文庫(kù)篩選結(jié)合不同表位的配對(duì)抗體來(lái)建立更高效特異的抗原檢測(cè)方法，即檢測(cè)所形成的捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體夾心復(fù)合物。Zhang 等[19]的研究基于5 例SARS-CoV-2 感染者的外周血構(gòu)建了噬菌體抗體庫(kù)，以N 蛋白為靶標(biāo)，篩選出16 種抗體的親和力在16 nmol/L 至0.069 nmol/L范圍內(nèi)，具有較高親和力，其中JS08 抗體具有獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)， 有助于了解靶向抗原表位， 通過(guò)夾心ELISA 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JS08 與 JS16 抗體配對(duì)良好， 可作為一對(duì)抗體對(duì)來(lái)檢測(cè)SARS-CoV-2，檢測(cè)限在 0.78 ng/mL 以下。 Kim 等[20]認(rèn)為，在抗體對(duì)的開(kāi)發(fā)中，高親和力的抗體用作捕獲抗體可提高檢測(cè)靈敏度。 Anderson 等[21]用重組N 蛋白對(duì)美洲駝進(jìn)行免疫來(lái)制備噬菌體展示文庫(kù)， 將靶向N 蛋白篩選得到的親和力最高的E2 重鏈抗體作為捕獲抗體，并與一同篩選得到的C2 抗體作為檢測(cè)抗體構(gòu)建成異二價(jià)體，與磁性微球結(jié)合，并放大檢測(cè)信號(hào)，其檢測(cè)限可達(dá)到50 pg/mL。 以上研究對(duì)于特異性檢測(cè)病毒抗原具有重要的價(jià)值。

SARS-CoV-2 檢測(cè)技術(shù)中關(guān)注簡(jiǎn)化操作步驟、 縮短檢測(cè)時(shí)間、減少檢測(cè)成本與醫(yī)療資源的占用等問(wèn)題。 采用單B 細(xì)胞分選技術(shù)分離制備抗體，或使用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體等過(guò)程相對(duì)繁瑣并且對(duì)技術(shù)設(shè)備要求較高[19]。 噬菌體展示技術(shù)制備抗體過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，可大規(guī)模開(kāi)發(fā)利用。將噬菌體展示技術(shù)獲得的抗體與側(cè)向流動(dòng)免疫層析（LFIA）技術(shù)結(jié)合， 可為開(kāi)發(fā)SARS-CoV-2 快速抗原檢測(cè)試劑卡或?yàn)殚_(kāi)發(fā)即時(shí)檢測(cè)產(chǎn)品提供技術(shù)支持。 Kim 等[20]使用雞源天然噬菌體scFv 庫(kù)靶向N 蛋白進(jìn)行篩選， 得到結(jié)合力最佳的抗體對(duì) 12H8-12H1， 其基于 LFIA 的病毒檢測(cè)限為 2 ng/反應(yīng)和2.5×104pfu/反應(yīng)， 進(jìn)一步利用 12H8-12H1 開(kāi)發(fā)基于 LFIA 的生物傳感器，20 min 內(nèi)肉眼可看到結(jié)果。 此外采用手持式LFIA 讀取器可實(shí)現(xiàn)定量和更準(zhǔn)確的分析，對(duì)于即時(shí)檢測(cè)、床旁檢測(cè)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)以及患者體內(nèi)病毒的監(jiān)測(cè)具有重要意義。

四、噬菌體展示技術(shù)在新冠肺炎治療和免疫預(yù)防中的應(yīng)用

SARS-CoV-2 通過(guò)S 蛋白的RBD 與宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞，因此研發(fā)比ACE2 與RBD 結(jié)合更緊密的中和抗體，可以阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞，達(dá)到預(yù)防或治療的目的[22-23]。 噬菌體展示技術(shù)可在中和抗體的制備、納米抗體藥物和疫苗的研發(fā)方面發(fā)揮一定作用。

1.中和抗體的制備與優(yōu)化

噬菌體展示技術(shù)可作為篩選中和抗體的有效工具。 Kim等[24]利用恢復(fù)期患者B 細(xì)胞構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行靶向篩選，經(jīng)重構(gòu)得到CT-P59 中和抗體，歐洲藥品管理局對(duì)CTP59 在輕至中度新冠門(mén)診患者中的安全性和有效性評(píng)估后，正在進(jìn)行CT-P59 抗體的上市申請(qǐng)?jiān)u估。 由噬菌體展示技術(shù)制備的中和抗體STE90-C11 (COR-101)正處于Ⅰb/Ⅱ期臨床試驗(yàn)[25]，以評(píng)估其在中至重度新冠住院患者中的療效，該抗體噬菌體庫(kù)是利用恢復(fù)期患者外周淋巴細(xì)胞構(gòu)建的，通過(guò)靶向RBD 進(jìn)行篩選鑒定出的IgG，STE90-C11 能與大多數(shù)RBD 突變體結(jié)合，但與含有N501Y 突變的結(jié)合減少。

近來(lái)已發(fā)現(xiàn)許多SARS-CoV-2 變體， 其中一些與免疫逃逸有關(guān)[26]，因此研發(fā)針對(duì)不同表位的中和抗體對(duì)于降低逃逸風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。 噬菌體展示技術(shù)可更快發(fā)現(xiàn)針對(duì)不同表位的中和抗體。Qu 等[27]利用噬菌體庫(kù)篩選得到2 種高親和力抗體F61 和 H121， 結(jié)構(gòu)分析顯示 F61 識(shí)別 RBD 上與 ACE2 結(jié)合位點(diǎn)重疊的表位，H121 識(shí)別RBD 側(cè)面遠(yuǎn)離ACE2 結(jié)合區(qū)的表位，F(xiàn)61 與H121 通過(guò)結(jié)合三聚體S 蛋白中RBD 而使其處于閉合狀態(tài)，無(wú)法結(jié)合ACE2，這2 種抗體的混合物對(duì)包括B.1.1.7 和B.1.351 在內(nèi)的病毒變體顯示出有效的中和活性，并可與N501Y、E484K 和L452R 突變發(fā)生反應(yīng)， 對(duì)降低病毒變體逃逸風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

相比于免疫動(dòng)物體內(nèi)篩選、單B 細(xì)胞分選等方法[28]，噬菌體展示庫(kù)的優(yōu)勢(shì)在于可采用的抗體片段形式較多，并且可作為分離不同中和抗體的可重復(fù)使用來(lái)源，其產(chǎn)生的抗體中和活性可同單細(xì)胞分選產(chǎn)生的抗體中和活性一樣達(dá)到納克級(jí)[29-30]。 另外，噬菌體展示技術(shù)分離出的抗體還可經(jīng)過(guò)快速工程改造顯著提高其中和活性。 Huo 等[31]將噬菌體抗體庫(kù)篩選與基于PCR 誘導(dǎo)的親和力成熟法結(jié)合，誘導(dǎo)抗體CDR3 區(qū)域突變，獲得了親和力更高的抗體。 Ma 等[32]利用從噬菌體抗體庫(kù)中篩選分離出的抗體，融合構(gòu)建了兩種異二價(jià)抗體，使其親和力比單價(jià)抗體增強(qiáng)10 倍以上， 并且中和效力也顯著增強(qiáng)，中和活性達(dá)到納克級(jí)。

2.納米抗體的制備

利用噬菌體展示技術(shù)制備抗SARS-CoV-2 納米抗體新型藥物的開(kāi)發(fā)研究也逐漸受到關(guān)注。 納米抗體來(lái)源于駱駝科動(dòng)物的純重鏈抗體，與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，組織穿透力更強(qiáng)并且能夠靶向傳統(tǒng)抗體無(wú)法接近的表位[33]。 傳統(tǒng)方法獲得特異性納米抗體需要抗原免疫動(dòng)物， 操作繁瑣、周期較長(zhǎng)，而噬菌體展示技術(shù)通過(guò)構(gòu)建納米抗體噬菌體庫(kù)靶向特異性抗原進(jìn)行篩選，降低了免疫動(dòng)物所需成本，且所需時(shí)間短，產(chǎn)率高，適合大規(guī)模生產(chǎn)，為快速生產(chǎn)低成本高質(zhì)量的抗病毒藥物提供機(jī)會(huì)。Ye 等[34]利用未免疫駱駝科動(dòng)物B 細(xì)胞構(gòu)建了天然納米抗體噬菌體庫(kù)，以RBD 為靶標(biāo)進(jìn)行篩選，經(jīng)與Fc 標(biāo)簽連接后， 得到的高親和力Nanosota-1C-Fc 抗體與RBD 的結(jié)合力為ACE2 與RBD 的3 000 倍，并且單劑量注射能有效地預(yù)防和治療倉(cāng)鼠及hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠的SARSCoV-2 感染。 此外，Nanosota-1C-Fc 具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性，在小鼠體內(nèi)注射經(jīng)3 d 后，其在血液、肺、心臟、肝臟和脾臟中仍保持高水平。Wu 等[35]利用納米抗體噬菌體庫(kù)得到的n3088和n3130 抗體通過(guò)靶向三聚體S 蛋白隱蔽表位來(lái)中和SARS-CoV-2，其在靶向隱蔽表位方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

3.疫苗的開(kāi)發(fā)

由于噬菌體顆粒固有的免疫原性更易誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且具有穩(wěn)定、低成本等優(yōu)點(diǎn)，其作為疫苗載體已被廣泛研究[36]，因此在新冠疫苗的開(kāi)發(fā)中也具有良好的應(yīng)用前景。 最近，Staquicini 等[37]報(bào)告了基于噬菌體展示的新冠靶向疫苗的開(kāi)發(fā)研究，研究者對(duì)S 蛋白結(jié)構(gòu)分析后選擇6 個(gè)抗原表位分別克隆到噬菌體載體f88-4 基因組的PⅧ中， 其中表位4 展示噬菌體可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生持續(xù)的特異性體液免疫，并且無(wú)其他不良反應(yīng)，之后研究者還通過(guò)噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選出可與肺氣道和肺泡內(nèi)壁細(xì)胞表面結(jié)合的肽CAKSMGDIVC[38]，將其克隆插入到噬菌體載體fUSE55 的PⅢ中，構(gòu)建雙展示噬菌體顆粒，相比于表位4 單獨(dú)展示噬菌體顆?？梢哉T導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。 雙展示噬菌體顆粒通過(guò)霧化給藥靶向肺部使其轉(zhuǎn)運(yùn)至體循環(huán)，可不受首過(guò)代謝的影響，對(duì)新冠疫苗的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

五、結(jié)語(yǔ)

鑒于目前檢測(cè)SARS-CoV-2 方法的優(yōu)勢(shì)與局限性， 檢測(cè)技術(shù)間的相互補(bǔ)充，可以縮短病毒檢測(cè)的窗口期，提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。 噬菌體展示技術(shù)憑借其高特異性、高通量和低成本等優(yōu)點(diǎn)， 在SARS-CoV-2 的檢測(cè)以及新冠肺炎的預(yù)防與治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)實(shí)現(xiàn)疑似人群的早期分流和快速管理具有重要意義，但噬菌體展示技術(shù)在SARSCoV-2 的應(yīng)用研究中仍需改進(jìn)， 當(dāng)構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)時(shí)，若能擴(kuò)大抗體庫(kù)的多樣性，或許可以獲得親和力更高、性能更良好的抗體， 另外獲得的抗體片段需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行改造，以提高其在實(shí)際臨床應(yīng)用中的穩(wěn)定性以及功能效應(yīng)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突