蘇毅馨，朱世杰，薛 鵬，毛 昀，李林潞

(中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102)

阿霉素(doxorubicin，Dox)是一種高效的蒽環(huán)類化療藥物，可用于治療一些兒童和成人腫瘤，但具有劑量依賴性心臟毒性，可引起亞臨床心室功能障礙，甚至導致嚴重的心肌病和心力衰竭[1]。盡管經歷數(shù)十年研究，在分子及病理生理學方面取得了重大進展，但仍存在缺乏敏感的預測生物標記物、治療藥物及機制未完全闡述等問題。因此迫切需要早期診斷及探索新的治療靶點來防治Dox誘導的心臟毒性。

microRNA (miRNA)是一類內源性的保守的小分子(22-24核苷酸)非編碼RNA，可抑制和/或降解目標信使RNA，影響基因表達轉錄后調控進而調節(jié)多種生物過程，如細胞增殖、分化、發(fā)育和死亡等，若miRNA功能失調，可引起腫瘤或者心臟病[2]。由于miRNA在幾乎所有體液(血液、血清、血漿、尿液和唾液)中穩(wěn)定表達，具有組織特異性，且其檢測的精確定量技術發(fā)展[3]，已成為多種疾病的可能特異性生物標志物及治療靶點研究對象[4]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA不僅參與調節(jié)心臟電信號傳導、心肌收縮，也可作為心血管疾病的非侵入性和特異性的循環(huán)標志物[5-7]，目前亦有研究在阿霉素引起的心臟毒性方面進行臨床相關性及機制探討[8,9]，因此該綜述將針對miRNA在阿霉素心臟毒性的生物標記物、機制方面的研究進展具體論述。

1 生物標記物

目前指南[10]推薦肌鈣蛋白(cTn)、腦利鈉肽(BNP)作為血液循環(huán)生物標志物用于監(jiān)測蒽環(huán)類藥物誘導的心臟毒性，cTn雖是心臟損傷的金標準，但僅在心臟壞死時釋放[11]，考慮到目前生物標志物的局限性，因此迫切需要識別新的穩(wěn)定、高靈敏度生物標志物以鑒定心臟損傷早期事件及限制損傷程度。下面為更清楚闡述關于miRNA在Dox心臟毒性中作為生物標記物的研究，將通過研究者單個miRNA研究及成組miRNA研究進行闡述。

1.1 單個miRNA研究

2012年Fu等[12]首次報道Dox誘導的心臟損傷模型中l(wèi)et-7g的血漿濃度與心臟功能指標cTnT等具有相關性。在Dox劑量為18 mg/kg的實驗組中表現(xiàn)出明顯let-7g下調并伴有心率下降，但作者的討論主要集中在可能靶點的數(shù)據(jù)方面，并未通過進一步實驗來驗證推測[11]；2015年Oliveira Carvalho等[13]對59名乳腺癌含阿霉素化療方案患者化療周期前后檢測miR-208a表達，將血清cTnI血清水平高于40 pg/mL，LVEF相對于基線值明顯下降為心功能異常參考值。研究結果表明7名患者 (11.86%)出現(xiàn)心臟毒性癥狀，cTnI升高，LVEF降低，但令人失望的是在該7名患者中均未檢測到miR-208a表達，因此miR-208a不能作為Dox誘導心臟毒性的乳腺癌患者有用的生物標志物；2017年，Rigaud等[14]利用CECCY試驗的一個分支(ClinicalTrials.govNCT01724450)研究miRNA作為可能的心臟毒性循環(huán)標志物的適用性。研究對象為56名女性乳腺癌含阿霉素化療方案患者，每化療周期后3周檢測血漿cTnI、miR-1、miR-133b、miR-146a、miR-208a、miR-208b、miR-423-5p水平。上訴選取研究的miRNA中除miR-146a外，余均在文獻中記載為心臟疾病(心肌損傷、心力衰竭、藥物誘導心臟毒性)的循環(huán)標志物[15,16]，將化療期間或化療后LVEF較基線降低≥10%和/或LVEF值<50%為心臟毒性標準。研究結果表明從基線到Dox治療結束的每個周期后，cTnI的平均血漿水平均升高但變化無統(tǒng)計學意義，miRNA表達分析表明所有受試者的miR-1均隨時間呈上升趨勢，其表達水平與LVEF變化相關，與非心臟毒性患者相比具有統(tǒng)計學意義。miR-208a和miR-208b未檢測到，miR-133b、-146a和-423-5p雖可檢測到，但未顯示與心臟毒性發(fā)作相關的表達變化，均不能成為有效的循環(huán)標志物，因此循環(huán)miR-1可作為阿霉素誘導的乳腺癌患者心臟毒性的潛在生物標志物；Ruggeri等[9]研究表明在急性蒽環(huán)類藥物給藥后，miR-34a-5p在表達水平升高，有趣的是，除Dox誘導的心臟毒性[17]外，miR-34a-5p升高提示與心肌梗死后心室重構和心衰發(fā)作相關[18,19]，抑制其表達對心臟功能障礙有益[20]，提示其可能作為一種生物標志物和治療靶點進行臨床開發(fā)。

1.2 成組miRNAs研究

2014年，Desai等[21]對1 179個miRNAs進行了表達譜分析。研究者將雄性B6C3F1小鼠實驗組予3 mg/kg Dox靜脈注射，累積劑量分別為6～24 mg/kg，研究結果表明予18 mg/kg和更高累積劑量的Dox的小鼠出現(xiàn)心臟損傷，共24個miRNAs在小鼠心臟中有差異表達，其中促凋亡的miR-34a是所有累積劑量下唯一上調的miRNA，并呈劑量相關性。當Dox累積劑量6 mg/kg時，miR-34a上調可能提示凋亡是經Dox處理的小鼠心臟的早期分子變化。累積劑量12 mg/kg時，miR-34a上調與心肌細胞肥大miR-150下調相關。該實驗提示miR-34a可能作為在心肌肌鈣蛋白釋放之前的早期生物標志物；Leger等[22]對33名癌癥兒童在接受蒽環(huán)類化療方案 (n=24)或非蒽環(huán)化療(n=9)前后進行了24種miRNA的血漿分析，在兩組治療前后(6、12、24 h)的測定miRNA變化，并進行組間比較。研究結果表明實驗組在用藥6～24 h后血漿miR-29b和miR-499上調，其化療后表達與劑量顯著相關，且表達高于對照組。該研究提示對miRNAs的進一步評估可能為阿霉素誘導的心臟毒性的生物標志物；Ruggeri等[23]選用20只C57BL/6雌性小鼠為研究對象，實驗組在2周內予24 mg/kg劑量DOX，研究周期6周，實驗前后予心功能監(jiān)測及miRNA水平檢測，研究結果為實驗組中有5只小鼠與對照組相比心功能無顯著性差異，對發(fā)生心臟毒性組小鼠血漿予miRNA檢測，檢測結果為miR-1-3p、miR-122-5p、miR-127-3p、miR-133a-3p、miR-215-5p、miR-455-3-p和miR-499a-5p 7種miRNA下調，而miR-34a-5p在Dox處理組血漿樣本中水平升高，該研究表明予Dox后實驗動物可對治療表現(xiàn)出不同的心臟反應，并且存在特異性的miRNA，其表達可反映藥物誘導損傷后心臟功能障礙的存在。

2 機制研究

阿霉素心臟毒性有別于靶向治療以及免疫治療引起的心臟毒性，其引起的心肌損傷呈劑量相關性，伴有心肌細胞死亡，但其心臟毒性機制至今仍未完全明確，目前廣泛研究的機制包括氧化應激損傷機制、拓撲異構酶Ⅱ機制、線粒體功能受損等。miRNA在其機制方面研究也主要集中在細胞凋亡、影響相關信號通路方面，闡述如下：

2.1 細胞凋亡

張曉潔等[24]研究發(fā)現(xiàn)Dox處理后心肌細胞中miRNA-532-3p的表達明顯升高，可引起ARC下調，ARC(apoptosis repressor with caspase recruitment domain)是一個內源性抗凋亡蛋白，可同時抑制內源和外源的凋亡途徑，miR-532-3p可以靶向ARC的3' UTR。抑制miR-532-3p可明顯抑制DOX引起的線粒體分裂和凋亡，且miR-532-3p可以直接作用于ARC3'UTR而抑制ARC的表達。因此MiR-532-3p通過調控ARC的表達參與Dox引起的心肌細胞線粒體分裂和細胞凋亡，并且抑制miR-532-3p并不影響Dox引起的腫瘤細胞凋亡；唐玉婷等[25]研究發(fā)現(xiàn)Dox引起心肌細胞損傷后可引起miR-126-5p表達明顯上調，LDH的釋放增加及caspase-3活性升高，降低心肌細胞活性，促進心肌細胞凋亡，發(fā)揮促心肌損傷作用；Jing等[26]研究發(fā)現(xiàn)miR-29b是miR-29家族中唯一在經Dox處理的大鼠心肌中顯著下調的成員。上調miR-29b表達可抑制Dox誘導的心肌凋亡，使Bcl-2表達升高，Bax表達降低，caspase-3活性降低。miR-29b通過直接靶向Bax,通過抑制線粒體依賴途徑來阻止Dox誘導的心肌凋亡，這表明miR-29b是治療Dox心臟毒性的一個潛在的新的治療靶點。

2.2 線粒體損傷

Du等[27]研究發(fā)現(xiàn)Dox濃度升高可顯著增加MiR-23a的表達。抑制miR-23a可顯著提高心肌細胞的生存力和減少細胞死亡和ROS的產生。miR-23a抑制靶標PGC-1α表達及Drp1的磷酸化水平，但不影響Mfn2的表達，抑制Cyt C和裂解的caspase-3蛋白表達。因此在阿霉素誘導的心臟毒性細胞模型中，miR-23a可促進線粒體損傷。抑制miR-23a作用于 PGC-1α/ p-Drp1而抑制線粒體依賴細胞凋亡及心肌損傷。

2.3 調節(jié)靶基因

miR-146a在心臟中表達豐富，2010年Takahiro等[28]首次發(fā)表研究報告表明由Dox引起心臟毒性的動物模型中miRNA的表達受干擾。予20 mg/g DOX治療1 d后，雄性C57BL/6小鼠心臟中ErbB2受體酪氨酸激酶4 (ErbB4)表達明顯降低，ErbB4 3'UTR是miR-146a的一個可靠靶點。Dox誘導的心肌凋亡可能與miR-146a介導下調ErbB4相關，但目前仍缺乏體內實驗數(shù)據(jù)支持miR-146a為誘導Dox心臟毒性的因果機制；miR-21參與心力衰竭、心肌纖維化、心肌凋亡過程[29-31]?；谏鲜鲅芯砍晒琓ong等[32]研究miR-21在Dox介導的急性、慢性心臟毒性中的表達。研究結果表明miR-21過表達減輕心肌凋亡，其機制與miR-21的靶基因B細胞易位基因2 (BTG2)相關，Dox引起心肌細胞細胞中BTG2的表達明顯降低，miR-21可能通過BTG2靶向基因保護心肌細胞。然而,盡管BTG2被證實是miR-21的一個可靠靶點，但其在細胞凋亡中的作用仍未研究清楚；Hui等[33]研究表明，核苷通過miR-21的表達參與調控阿霉素誘導的心臟損傷和功能障礙，可能是一個新的治療靶點；Roca-Alonso等[34]研究發(fā)現(xiàn)miR-30家族在Dox誘導的心力衰竭中下調，高miR-30水平對Dox心臟毒性具有保護作用，可減少活性氧生成。機制可能為通過靶點Giα-2調節(jié)β-腎上腺素能通路，減弱心肌細胞對β-腎上腺素受體 (βAR)刺激的收縮反應。miR-30家族亦可靶向作用促凋亡基因BNIP3L/NIX調節(jié)心肌凋亡。此外研究認為Dox可誘導GATA-6表達導致心肌細胞中miR-30的急性和持續(xù)下調。miR-30過表達可保護心肌細胞不受劑量誘導的凋亡，因此維持其表達可能對蒽環(huán)類藥物是一種潛在的心臟保護策略。該項研究首次探討了miR-30家族對Dox心臟毒性影響，可能為未來的治療應用提示了新的思路，但仍缺乏體內研究，需要進一步研究證實其作用機制；miR-208a是一種調節(jié)心臟應激反應的心臟特異性microRNA，在心梗、擴張型心肌病等多種心臟疾病中均有上調，并與不良預后相關[35]，在已證實的miR-208a的靶點中，GATA4是一種心臟富轉錄因子，已知它可調控包括抗凋亡基因BCL-2在內的幾種心臟基因的表達[36]。GATA4耗竭是阿霉素導致心肌細胞凋亡的獨特機制，而維持GATA4水平已被證明可減輕阿霉素誘導的心肌細胞凋亡和心功能障礙，Tony等[37]研究發(fā)現(xiàn)阿霉素明顯上調miR-208a，下調GATA4，增加心肌細胞凋亡，導致心功能下降。而抑制miR-208a表達可增加GATA4和BCL-2，減少細胞凋亡，改善心功能；miR-140-5p直接靶向Nrf2和Sirt2，影響HO-1、NQO1、Gst、GCLM、Keap1和FOXO3a的表達水平[38]，從而增加了Dox引起的心肌損傷。因此，miR-140-5p通過靶向Nrf2和Sirt2促進心肌氧化應激，在Dox誘導的心臟毒性中發(fā)揮重要作用。為研究阿霉素引起的心臟損傷提供了新的見解。此外，miR-140-5p/ Nrf2和miR-140-5p/Sirt2可能成為治療劑量誘導的心臟毒性的新靶點；Gupta等[39]發(fā)現(xiàn)在Dox介導的心臟毒性動物模型中miR-212/132過表達，可抑制左室質量增加和左室壁心肌萎縮厚度，減少細胞凋亡防止肌原纖維損傷。脂肪儲存誘導跨膜蛋白質2 (Fitm2)和下游效應體分子可能為其作用靶點；Piegari等[40]研究表明在予Dox處理后心肌細胞中的miR-34a水平升高，且抑制miR-34a有益于心肌祖細胞增殖、凋亡和衰老。機制為miR-34a靶向升高Bcl-2和SIRT1，降低p53和p16INK4a乙?；?。抑制miR-34a也可減少對其他心肌細胞的負旁分泌作用影響；Vacchi-Suzzi等[41]研究報道Dox誘導的慢性心肌毒性與多種miRNAs和心肌疾病相關基因轉錄的調節(jié)有關。該研究中Dox的累積劑量范圍為2-18 mg/kg。隨劑量增加可特異性地誘導大鼠心臟中miR-208b、miR-216b、miR-215、miR-34c和miR-367的上調。此外，最低劑量(1 mg/kg/周，持續(xù)2周)可導致miR-216b在沒有發(fā)現(xiàn)組織病理學或經典心臟應激生物標志物改變的情況下顯著升高。miR-34c可在轉錄后水平介導由Dox誘導的Sipa1 mRNA(一種絲裂原誘導的Rap/Ran GTPase激活蛋白)的變化。上訴作用靶點的機制發(fā)現(xiàn)可能為治療Dox介導的心臟毒性提供新的思路。

2.4 信號通路

Chen等[42]研究發(fā)現(xiàn)miR-320a可通過增加多種危險因素和下調SRF參與動脈粥樣硬化形成并且使用蒽環(huán)類聯(lián)合化療的患者循環(huán)miR-320a降低?；谏显V研究成果進行基礎實驗[43]，研究表明予Dox處理后小鼠心肌miR-320a表達增強，心肌微血管密度降低，心功能受損。miR-320a過表達增強細胞凋亡，加重心臟血管異常，進而加重小鼠心功能障礙。而miR-320a下調可促進體外培養(yǎng)的內皮細胞增殖，抑制細胞凋亡，減輕阿霉素引起的心功能異常。其機制為miR-320a通過潛在靶點VEGF-A抑制影響心臟血管內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，通過調節(jié)VEGF信號通路在阿霉素誘導的心臟毒性中發(fā)揮重要作用，因此，抑制miR-320a可能用于治療蒽環(huán)類藥物引起的心功能障礙；Wan等[44]研究了miR-15b-5p在阿霉素劑量誘導的心臟毒性中的作用。研究發(fā)現(xiàn)在暴露于Dox的H9c2心肌細胞中，miR-15b-5p表達上調，Bmpr1a和Gata4 mRNA表達下調。Bmpr1a被認為是miR-15b-5p的潛在靶點，miR-15b-5p可能通過影響B(tài)cl-2/Bax的蛋白表達比例和Akt的激活加劇Dox誘導的細胞凋亡，而這種促凋亡作用可被Bmpr1a激動劑抑制，對Bmpr1a信號通路的負調控作用；Li等[45]探討miR-451對dox誘導的小鼠心臟毒性的影響。研究表明miR-451在阿霉素處理組心肌細胞中顯著升高。抑制miR-451表達可減輕阿霉素誘導的心肌細胞凋亡，并上調鈣結合蛋白39 (Cab39)和活化的磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信號通路的表達。

3 討論

由于miRNA的組織特異性及穩(wěn)定性，檢測miRNA表達可以提供有價值的阿霉素心臟毒性的早期基因組生物標志物以及對潛在分子通路的新機制的深入了解，為治療提供新的思路，但仍面臨著挑戰(zhàn)及限制。如篩選候選miRNA時主要根據(jù)既往阿霉素心臟毒性機制以及研究miRNA數(shù)目較少，這一選擇可能會限制對新穎性和潛在的新發(fā)現(xiàn)；其次部分研究對研究樣本只提到心臟樣本，未標明整個心臟還是部分心臟或心臟特定組織如心房或心室被用于分析，因此很難對不同的研究進行比較；缺乏多中心、大樣本的臨床研究；最后，最重要的問題是RT-qPCR評估m(xù)iRNA表達的標準化策略，可影響研究結果的重復性。因此，準確的和被廣泛接受的研究方案應該被執(zhí)行和采用，為獲得具有很強臨床相關性的結果鋪平道路。