張學(xué) 綜述，江文文 審校

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650118

腺苷酸環(huán)化酶毒素（adenylate cyclase toxin，ACT）是在百日咳桿菌對(duì)數(shù)增長期培養(yǎng)基上清中發(fā)現(xiàn)并純化出來的，與細(xì)菌胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）功能相似，可催化三磷酸腺苷（ATP）向環(huán)狀單磷酸腺苷（cAMP）轉(zhuǎn)化。在全細(xì)胞百日咳（whole cell per-tussis，wP）疫苗中也發(fā)現(xiàn)有 AC 活性的存在［1］，AC 與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后，其酶活性可增加100 ~ 1 000倍，鈣調(diào)蛋白僅存在于真核細(xì)胞胞漿中，表明百日咳桿菌的AC 與真核細(xì)胞存在一定關(guān)系［2］，百日咳桿菌分泌的這種具有AC 活性的物質(zhì)能穿透并進(jìn)入真核細(xì)胞（吞噬細(xì)胞），使吞噬細(xì)胞內(nèi)生成超生理水平的cAMP，從而降低吞噬細(xì)胞的殺菌能力。同時(shí)WEISS 等［3］將分離的1 株Tn5 轉(zhuǎn)座子突變百日咳桿菌株（BP348），即無AC 活性和溶血活性的百日咳桿菌感染幼鼠后，其對(duì)幼鼠的毒力損傷比常規(guī)百日咳桿菌大幅減弱，且10 d 內(nèi)可迅速從小鼠肺部清除，表明ACT 是百日咳桿菌感染早期所必需的定植毒力因子［4］。

1 ACT 的生物特性

ACT 由百日咳桿菌CyaA 基因編碼表達(dá)，是其主要的致病因子之一，在百日咳桿菌感染呼吸道早期定植中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ACT 全長含有1 706 個(gè)氨基酸，具有AC 活性和溶血素活性的雙重功能，其完整的活性依賴于賴氨酸?；D(zhuǎn)移酶（cyclolysin activating lysine acyltransferase，CyaC）基因編碼的 CyaC對(duì)ACT 的860 和983 位賴氨酸進(jìn)行棕櫚酰化修飾。ACT 的N-末端364 個(gè)氨基酸殘基具有AC 活性，即腺苷酸環(huán)化酶域（adenylate cyclase domain，ACD）；C-末端 1 342 個(gè)氨基酸（365 ~ 1 706 位氨基酸殘基）負(fù)責(zé)AC 易位，具有溶血素活性，即溶血素域（hemolysin，Hly）［5］。ACD 在 C-末端 Hly 的輔助下進(jìn)入靶細(xì)胞［6］，由胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白激活并催化ATP 向cAMP超生理水平生成［7］。Hly 由以下幾個(gè)區(qū)域組成：①易位域（translocation region，TR），即365~527 位氨基酸殘基，參與ACD 轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞過程，并可提高細(xì)胞膜的通透性，具有膜活性肽的特征；②疏水域（hydrophobic region，HR），即 528 ~ 710 位氨基酸殘基，插入細(xì)胞膜并形成陽離子孔［8］；③?；颍╝cylation region，AR），即711 ~ 1 005 位氨基酸殘基，包括影響ACT有效折疊和AC 域移位的兩個(gè)?；稽c(diǎn)（860 和983位賴氨酸）；④重復(fù)子毒素域（RTX domain，RD），即1 006 ~ 1 600 位氨基酸殘基，由富含甘氨酸和天冬氨酸的9 肽重復(fù)序列形成5 個(gè)區(qū)段，可與靶細(xì)胞受體結(jié)合，另外，RD 也是鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，在鈣離子的存在下，9 肽重復(fù)序列進(jìn)行有序折疊，使ACT 具有AC活性［9］；⑥C-末端分泌信號(hào)肽（secretion signal，S），由細(xì)菌Ⅰ型分泌系統(tǒng)（typeⅠsecretion system，TⅠSS）識(shí)別［10］。

ACT 在細(xì)菌胞質(zhì)中經(jīng)CyaC 蛋白修飾為有活性的蛋白，破壞宿主固有免疫防御系統(tǒng)，穿透靶細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）、嗜中性粒細(xì)胞及非吞噬細(xì)胞［11］，使靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的cAMP，進(jìn)而損害吞噬細(xì)胞的殺菌能力［12］，使百日咳桿菌能夠在宿主呼吸道上定植。ACT 的AC 域易位進(jìn)入表面有補(bǔ)體受體 3（CR3，CD11b ／ CD18）的靶細(xì)胞內(nèi)分為兩步［13-14］：①ACT 與分散在脂質(zhì)筏外部的受體 CD11b ／ CD18 結(jié)合，使 CD18 亞基的胞質(zhì)尾部通過連接蛋白（talin）束縛在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上；②與受體結(jié)合后，ACT 的“易位中間體”插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層，其中ACD 與Hly 一起滲透至細(xì)胞膜中，并參與瞬時(shí)打開Ca2+傳導(dǎo)路徑；細(xì)胞外的鈣離子流入細(xì)胞，誘導(dǎo)Ca2+依賴性鈣蛋白酶（calpain）活化，使 action 蛋白和 talin 蛋白裂解，ACT-CD11b ／ CD18復(fù)合物從肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架中釋放；ACT-CD11b ／CD18 復(fù)合物募集至富含膽固醇的脂筏（lipid raft）中，其豐富的膽固醇和有序排列的磷脂分子幫助ACD 直接易位至宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)，ACD 在胞質(zhì)側(cè)暴露后，駐留在細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶從ACT 上切下，經(jīng)鈣調(diào)蛋白（CaM）激活，催化ATP 向cAMP 超生理水平生成［15］。ACT 作用于巨噬細(xì)胞，通過 ACD 進(jìn)入胞內(nèi)催化ATP 產(chǎn)生大量cAMP 等機(jī)制直接減弱巨噬細(xì)胞黏附病原菌的能力［16］，還可觸發(fā)成熟的初級(jí)肺泡巨噬細(xì)胞分化為單核細(xì)胞樣細(xì)胞，抑制巨噬細(xì)胞的殺菌能力［17］。ACT 還可作用于 DCs，使 DCs 內(nèi)的cAMP 濃度升高，高濃度的cAMP 通過增強(qiáng)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化、抑制干擾素調(diào)節(jié)因子-1（inter-feronregulatory factor-1，IRF-1）和干擾素調(diào)節(jié)因子-8（interferon regulatory factor-8，IRF-8）的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞因子白介素-10（interleukin-10，IL-10）的增多，并抑制促炎因子IL-12p70 生成［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，ACT 通過激活半光氨酸天冬氨酸酶（caspase-1）和胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)［19］，如細(xì)菌穿孔毒素應(yīng)答的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體，誘導(dǎo)DCs 產(chǎn)生和分泌IL-1β，使T 細(xì)胞應(yīng)答向輔助性 T 淋巴細(xì)胞 17（T helper cell 17，Th17）型轉(zhuǎn)變；ACT 通過破環(huán)DCs 介導(dǎo)百日咳桿菌免疫逃逸，同時(shí)減弱Th1，增強(qiáng)Th17 型應(yīng)答，后者應(yīng)答過強(qiáng)時(shí)，可能會(huì)加重肺部炎癥和損傷。另外，中性粒細(xì)胞也是ACT 攻擊的目標(biāo)。在小鼠呼吸道攻毒模型中，ACT通過誘導(dǎo)胞內(nèi)cAMP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及巨噬細(xì)胞環(huán)氧化酶-2（cyclooxy-genase-2，COX-2）的表達(dá)，從而釋放具有趨化性的前列腺素，并在上皮DCs 細(xì)胞膜上形成的陽離子通道，隨后鉀離子外流、形成NALP3 炎癥小體復(fù)合物、活化caspase-1、釋放促炎因子IL-1β，從而招募中性粒細(xì)胞到達(dá)感染部位成為ACT 的攻擊目標(biāo)［20］。ACT 除了能損傷固有免疫反應(yīng)的相關(guān)細(xì)胞，還能作用于適應(yīng)性免疫反應(yīng)的T 細(xì)胞。低濃度ACT 使 T 細(xì)胞分泌 IL-4、IL-13 等 Th2 型細(xì)胞因子，抑制 IFNγ 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等Th1 型細(xì)胞因子的生成，使T 細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)Th1 ／ Th2 平衡向Th2 偏移。大量的ACT 則可阻礙T 細(xì)胞活化，抑制T 細(xì)胞應(yīng)答。ACT與 T 細(xì)胞上免疫突觸（immunological synapse，IS）位置的淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）相互作用，使 LFA-1 過早脫離，并伴隨talin 蛋白的斷裂消失；IS 處是T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）和其他關(guān)鍵受體（如CD4／CD8、CD28 和LFA）微調(diào)和集成去驅(qū)動(dòng)T 細(xì)胞活化的部位，因此該部位生成的cAMP 可有效地靶向T 細(xì)胞活化的途徑，抑制T 細(xì)胞活化［21］。

綜上所述，百日咳桿菌的AC 通過破壞固有免疫反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞和T 細(xì)胞來延遲細(xì)菌的清除和免疫記憶的發(fā)展。因此，在研發(fā)下一代百日咳疫苗時(shí)既要考慮引起機(jī)體的體液免疫，還要考慮激發(fā)特異性T細(xì)胞免疫來對(duì)抗病原菌［22-23］。

2 ACT 在百日咳疫苗中的潛在應(yīng)用

2.1 作為保護(hù)性抗原的潛在價(jià)值 有研究表明，無論是主動(dòng)免疫wP 疫苗，還是自然感染的人群血清中均存在一定的ACT 抗體［24］。ACT 作為百日咳桿菌的一個(gè)毒力因子，不僅在細(xì)菌感染宿主的早期階段發(fā)揮重要作用，也是一個(gè)潛在保護(hù)性抗原。ACT 的保護(hù)性免疫原性依賴于CyaC 對(duì)983 位賴氨酸的修飾，可能是由于修飾的區(qū)域是免疫優(yōu)勢表位的一部分或CyaC 介導(dǎo)的修飾影響了分子構(gòu)象，從而暴露出免疫優(yōu)勢表位［25］。全長ACT 作為抗原對(duì)機(jī)體有一定的保護(hù)作用，但ACT 本身的毒性（AC 活性）使其在疫苗應(yīng)用方面受到一定限制。BETSOU 等［26］將天然ACT、重組ACT、ACT828-887（刪除ACT 的828 ~ 887 位氨基酸）、ACT385-828（刪除ACT 的385 ~ 828 位氨基酸）、ACT385-1489（刪除ACT 的385 ~ 1 489 位氨基酸）、ACTC1307（刪除 ACT 的 401 ~ 1 706 位氨基酸）、ACT217（刪除ACT 的1 499~1 706 位氨基酸）免疫的小鼠為實(shí)驗(yàn)組，以未經(jīng)免疫的小鼠為對(duì)照組，用百日咳桿菌活菌的亞致死量對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)攻擊，結(jié)果表明，活菌攻擊6 d 內(nèi)，對(duì)照組小鼠肺部的活菌迅速定植并繁殖，而天然ACT 和重組ACT 免疫的小鼠肺內(nèi)基本無百日咳桿菌繁殖，且3 d 后肺內(nèi)百日咳桿菌迅速減少，截短的重組ACT 衍生物與對(duì)照組相似。WANG 等［27］用抗體噬菌體展示文庫發(fā)現(xiàn)，抗體主要結(jié)合于ACT 的C-末端RTX 域，RTX 域具有免疫優(yōu)勢，能誘發(fā)中和抗體，封閉受體結(jié)合位點(diǎn)，表明RTX 域的結(jié)構(gòu)完整性對(duì)其保護(hù)活性至關(guān)重要。另外還發(fā)現(xiàn)，用ACT 免疫的小鼠血清抗體可識(shí)別RTX域中兩個(gè)新的不重疊中和表位，阻止了ACT 與小鼠單核巨噬細(xì)胞（J774A.1）結(jié)合，且RTX 域免疫小鼠的血清與ACT 免疫小鼠血清有相似的中和活性。對(duì)這兩個(gè)表位的準(zhǔn)確位置進(jìn)行定位發(fā)現(xiàn)，RTX751（751 ~ 1 706 位氨基酸殘基）與這兩個(gè)表位的單克隆抗體親和力最佳［28］。將RTX751 添加至適當(dāng)劑量的無細(xì)胞百日咳（acelluar pertussis，aP）疫苗中，能增強(qiáng)小鼠抵抗百日咳桿菌感染的能力［29］。上述結(jié)果提示，在下一代aP 疫苗中，可考慮用RTX751 作為一種保護(hù)性抗原。

2.2 ACT 對(duì)共給抗原的佐劑效應(yīng) 對(duì)wP 疫苗和aP 疫苗免疫后所引起的免疫反應(yīng)類型分析表明，wP疫苗主要引起Th1 ／ Th17 細(xì)胞免疫，而aP 疫苗引起Th2 ／ Th17 型免疫［30］。ROSS 等［30］研究表明，在抵御百日咳桿菌的感染病程中，Th2 細(xì)胞免疫是非必須的，而誘導(dǎo)特異的Th1 型細(xì)胞免疫對(duì)百日咳的預(yù)防保護(hù)效果是重要的，在下一代aP 疫苗中應(yīng)加入能誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞免疫的佐劑，以此來提高aP 疫苗的保護(hù)效果。ACT 與百日咳桿菌的其他抗原組分共同免疫小鼠時(shí)，所得相應(yīng)抗體水平均比單獨(dú)使用這些抗原組分產(chǎn)生的抗體水平高。鑒于ACT 本身的毒性，MACDONALD-FYALL 等［31］通過基因技術(shù)在 ACT 蛋白的第188 和189 位氨基酸之間插入亮氨酸-谷氨酰胺二肽，得到一種無AC 活性的ACT 蛋白（ACT*）；CHEUNG 等［32］分別用 ACT、ACT*、翻譯后未修飾的ACT（前體 ACT）、翻譯后未修飾的 ACT*（前體 ACT*）聯(lián)合aP 疫苗免疫小鼠，結(jié)果表明，與其他3 種蛋白比較，ACT*的佐劑效果最佳，可顯著降低小鼠肺部定植的細(xì)菌數(shù)量，增加血清PRN 的IgG2a 抗體水平，促進(jìn)脾細(xì)胞分泌大量IL-5、IL-6、IFNγ、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage-stimulating factor，GM-CSF）等細(xì)胞因子，還可促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更高的NO 水平，表明aP 疫苗聯(lián)合ACT*可將免疫反應(yīng)從典型的Th2 型轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌系?Th1 ／ Th2 型反應(yīng)，增強(qiáng) aP 疫苗的保護(hù)力。另外，ACT*還能誘導(dǎo)DCs 成熟，使其發(fā)揮免疫相關(guān)功能［33］。因此，ACT*作為一種新型的aP 疫苗佐劑，具有良好的應(yīng)用前景。

3 小 結(jié)

ACT 是百日咳桿菌的關(guān)鍵毒力因子之一，其免疫調(diào)節(jié)作用復(fù)雜且具有雙向性，一方面ACT 破壞宿主免疫細(xì)胞，協(xié)助百日咳桿菌逃脫宿主免疫系統(tǒng)的攻擊；另一方面ACT 類毒素可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。通過在ACT 的N-末端插入二肽，獲得無（或低）AC 活性的ACT*作為佐劑，當(dāng)其與aP 疫苗共同免疫小鼠時(shí)，可提高其他抗原的免疫原性，影響輔助性T 淋巴細(xì)胞的分化，協(xié)助aP 疫苗清除小鼠肺部定植的百日咳桿菌。因此ACT 有望成為aP 疫苗的候選組分，但其免疫原性、持久性和免疫效果尚需進(jìn)一步深入研究。