国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

實時熒光定量RT-PCR 在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用價值

2021-04-18 08:42趙志武
醫(yī)學(xué)信息 2021年7期
關(guān)鍵詞:麻疹病毒出疹麻疹

王 穎,趙志武

(天津市薊州區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗科,天津 301900)

麻疹(measles)是一種由于麻疹病毒導(dǎo)致的急性呼吸道感染病,患者臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、咳嗽、結(jié)膜炎等[1]。近年來,隨著生活節(jié)奏的加快以及飲食習(xí)慣的改變,麻疹的發(fā)病率逐年上升,且傳染性較強(qiáng),因此有效地預(yù)防措施至關(guān)重要。麻疹與急疹、藥疹、風(fēng)疹等具有一定的相似性,臨床鑒別診斷的難度較大,如何選擇有效地診斷方式,是目前臨床面臨的重要課題之一[2]。目前臨床中檢測麻疹病毒的常用方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、實時熒光定量RT-PCR 等,前者是傳統(tǒng)臨床診斷麻疹病毒的方法,而實時熒光定量RT-PCR 則是近年來出現(xiàn)的一種核酸檢測技術(shù),不僅檢測速度較快,且具有高敏感度、高靈敏度的特性[3]。本研究對比了ELISA 法與實時熒光定量RT-PCR 法在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用效果,旨在分析實時熒光定量RT-PCR 在麻疹病毒檢測中的應(yīng)用價值,具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年12 月~2020 年12 月天津市薊州區(qū)疾病預(yù)防控制中心收治的65例疑似麻疹患者作為研究對象,其中男性38例,女性27例,年齡1~13 歲,平均年齡(7.28±1.36)歲。患者臨床癥狀均表現(xiàn)為不同程度的發(fā)熱、咳嗽、結(jié)膜炎等。

1.2 方法 所有患者均在出疹后7 d 內(nèi)抽取血液樣本、采集咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測。抽取患者靜脈血2~3 ml,在4 ℃環(huán)境下離心處理,以2000 r/min 的速率持續(xù)離心10 min。離心結(jié)束后收集上層血液,在2℃~8 ℃環(huán)境下保存待測。

1.2.1 ELISA 法檢測 根據(jù)麻疹病毒IgM 抗體檢測試劑盒(珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司,產(chǎn)品注冊號:國食藥監(jiān)械<準(zhǔn)>字2014 第3401262 號)的說明書進(jìn)行操作,結(jié)束后空白調(diào)零,通過酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek 公司)得出450 nm 處吸光度值,或通過A450-630 nm 計算吸光度值,分析檢測結(jié)果。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR 檢測 在患者出疹第5天采集咽拭子樣本,通過無菌棉簽蘸取咽部分泌物,蘸取時應(yīng)避開口腔黏膜、舌等部位。置入添加3~5 ml病毒標(biāo)本保存于液內(nèi),在標(biāo)本袋頂端折斷棉簽。之后提取RNA,進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增。采用RT-PCR 法進(jìn)行檢測,嚴(yán)格按照試劑盒(江蘇碩世生物科技有限公司)說明書進(jìn)行操作,合理配置反應(yīng)體系,在PCR 儀(美國ABI 公司)中進(jìn)行擴(kuò)增實驗。反應(yīng)條件如下:逆轉(zhuǎn)錄溫度控制在50 ℃,時間為15 min,循環(huán)1 次;預(yù)變性溫度控制在95 ℃,時間為15 min,循環(huán)1 次;退火、變性、延伸溫度控制在94 ℃,時間為15 s,循環(huán)40 次。當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時,收集所有熒光信號。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩種方法檢測陽性率及不同采樣時間陽性檢出率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗,P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測陽性率比較 實時熒光定量RTPCR 檢測陽性率為29.23%(19/65),高于ELISA 法檢測陽性率的10.77%(7/65),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.923,P=0.009)。

2.2 不同檢測時間兩種方法陽性率比較 第1 天,ELISA 法檢測陽性率低于實時熒光定量RT-PCR法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);第5 天,ELISA 法檢測陽性率高于實時熒光定量RT-PCR 法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);其余時間段兩種方法檢測陽性率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 不同檢測時間兩種方法陽性率比較[n(%)]

3 討論

麻疹是國際范圍內(nèi)較常見的疾病類型,患者得病后會有發(fā)熱、出疹等癥狀。該疾病多發(fā)生于2 歲以下的患者,發(fā)病率約為40%~50%,其次為20~39 歲的患者,發(fā)病率為25%~35%[4]。近年來,疫苗在臨床得到了廣泛的應(yīng)用,但同時隨著病毒毒性變化以及成年麻疹病毒感染的發(fā)生率的上升,導(dǎo)致麻疹患者受到病毒感染后無明顯癥狀,不僅延長了診斷時間,也難以有效與風(fēng)疹等類似疾病鑒別,大大提高了臨床診斷的難度[5]。麻疹在發(fā)病的前后5 d,具有較高的傳染性,易感患者與感染源接觸后,發(fā)病率極高[6]。因此,臨床一旦發(fā)現(xiàn)疑似麻疹患者,應(yīng)給與高度重視,及時進(jìn)行相關(guān)臨床檢測,提高檢出率,保證診斷的及時性與準(zhǔn)確性,從而避免麻疹的廣泛傳播[7]。

傳統(tǒng)臨床對麻疹患者進(jìn)行相關(guān)檢測時,會提取患者的血液樣本或鼻咽部分泌物。當(dāng)麻疹患者出現(xiàn)皮疹時的第1 天即可檢測出麻疹病毒,因此臨床檢測對于早期麻疹的鑒別診斷中具有重要的作用。臨床檢測麻疹病毒的方式較多,其中ELISA 法和實時熒光定量RT-PCR 法是目前最常見的類型,和其他方法相比,這兩種方法的操作較為簡單,且可實現(xiàn)短時間內(nèi)檢測,靈敏度高[8]。多項研究顯示[9-11],實時熒光定量RT-PCR 相比ELISA 法對麻疹病毒的檢出率更高,可能是由于當(dāng)患者受到麻疹病毒感染后,特異性IgM 抗體反應(yīng)需要一定的時間,隨著采血時間的改變,診斷的結(jié)果也會發(fā)生一定的變化。若采血時間過早,可能導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性,若采血時間過遲,不僅會增加采血的難度,還可能錯過最佳的治療窗口時間,影響臨床療效,對患者的早期診斷與治療造成了嚴(yán)重的影響。由此可以看出,ELISA 法在臨床麻疹病毒的檢測中存在明顯的缺陷。本次研究結(jié)果顯示,實時熒光定量RT-PCR 檢測陽性率明顯高于ELISA 法,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。65例疑似麻疹患者均在出疹7 天內(nèi)采集樣本,ELISA 法出疹第1 天檢測陽性率為14.29%;,實時熒光定量RT-PCR 出疹第1 天檢測陽性率為73.68%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ELISA 法出疹第5 天陽性率為28.57%,實時熒光定量RT-PCR 法出疹第5 d 陽性率為0,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示,不同的采血時間其檢出率也有所不同。在出疹后的1~3 d,ELISA 法檢出率較高,當(dāng)出疹時間延長至4~7 d 時,ELISA 法檢出率有明顯的下降趨勢。因此,臨床對于疑似麻疹患者,應(yīng)在出疹后立即采集樣本,并通過ELISA 法檢測血清樣本IgM 體,若病毒檢測顯示特異性為陰性,則應(yīng)在出疹后4~28 d 內(nèi)再次檢測,從而有效控制疾病的傳播。實時熒光定量RTPCR 在麻疹病毒檢測方面具有明顯的優(yōu)勢,陽性率高于ELISA 法,且能夠在出疹后1 d 檢測出麻疹病毒,對早期診斷、治療具有重要的參考價值,還有利于控制疾病的傳播。

根據(jù)熒光定量RT-PCR 計數(shù)的特點(diǎn),檢測方法可分為絕對定量和相對定量兩種。絕對定量指的是通過對已知標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋,根據(jù)稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,曲線中ct 值與初始RNA 或eDNA 拷貝數(shù)有線性關(guān)系,醫(yī)務(wù)人員可以根據(jù)這種關(guān)系,通過分析CT 值明確未知樣品起始模板拷貝數(shù)[12]。使用這種方法時,首先需要架設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣品的擴(kuò)增效率相等,在稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時,要保證處于可測量的范圍內(nèi)。對于標(biāo)準(zhǔn)品的選擇較為多樣化,既可以是雙鏈DNA,也可以是單鏈DNA 或承載靶序列的eRNA[13]。該測量方法主要用于體液中病毒或腫瘤負(fù)荷的定量。絕對定量法的檢測準(zhǔn)確度與標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確度密切相關(guān)。但這種方法也存在一定的缺陷,即檢測時樣品中可能存在抑制劑,可能會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[14]。相對定量指的是在測量目的基因的同時,測量另一內(nèi)源性管家基因,先對目的RNA 的ct 值與管家基因ct 值進(jìn)行對比,根據(jù)結(jié)果設(shè)置目的RNA 的值,實現(xiàn)各個樣品之間的互相對比,能夠分析出不同樣品RNA 的相對表達(dá)量[15]和絕對定量相比,相對定量法的關(guān)鍵在于保證RNA 與內(nèi)源性管家基因的擴(kuò)增效率相同,否則也會對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響[16]。

在熒光定量RT-PCR 技術(shù)中,每個環(huán)節(jié)都至關(guān)重要,一旦出現(xiàn)人為失誤,就會對檢測的結(jié)果造成影響[17,18]。目前醫(yī)學(xué)界認(rèn)為Oligo(dT)是合成cDNA 的最佳選擇,特異性明顯高于其他隨機(jī)引物。該物質(zhì)僅會與帶有poly A+(多聚腺苷酸)尾巴的mRNA 結(jié)合,但是Oligo(dT)對RNA 序列的要求較高,不僅需要高質(zhì)量,還要保證是全長,因此甲醛固定經(jīng)石蠟包埋組織中提取的片段RNA 難以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄[19]。另一方面,在逆轉(zhuǎn)錄過程中若出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)或引物探針結(jié)合點(diǎn)位處于mRNA 的5 端時可能會造成影響,因此臨床使用時可以將Oligo(dT)與隨機(jī)引物混合使用,從而提高檢測的準(zhǔn)確率。最好的方法是選擇目標(biāo)特異性引物合成的cDNA 特異,這樣能得到較為精確的結(jié)果,但由于不同目標(biāo)的特異性RNA 逆轉(zhuǎn)錄需要單獨(dú)進(jìn)行,當(dāng)提取到的RNA 量較少時,會出現(xiàn)浪費(fèi)的情況[20];第三,抑制劑影響。RNA 在提取、純化所經(jīng)歷的各個環(huán)節(jié)中,都存在著不同的抑制劑,會對mRNA 的定量造成一定的影響,例如體液成分、血紅蛋白、尿素等。另一方面,DNA 片段、殘余抗凝劑等也會對PCR 的發(fā)生效率造成影響,不同的多聚酶對不同抑制劑的敏感性也有所區(qū)別,導(dǎo)致PCR 結(jié)果存在一定的誤差。因此,在選擇材料時,應(yīng)以耐熱DNA 多聚酶為主。此外,還有一些其他因素可能影響RT-PCR 的檢測結(jié)果,如實驗室、操作人員、公司試劑等,臨床中必須要對這些因素進(jìn)行全面的質(zhì)量控制,保證RT-PCR 的檢測質(zhì)量。

綜上所述,對麻疹病毒采取實時熒光定量RTPCR 檢測,具較高的陽性檢出率,降低麻疹漏診率,操作簡單,為麻疹疫情早期控制及處理起到積極的促進(jìn)意義。

猜你喜歡
麻疹病毒出疹麻疹
2013-2016 年江西省麻疹病毒分離株H基因特征分析
觀疹識病
麻疹病毒流行株血凝素基因的變異及抗原性變異研究
Diagnosis and Treatment of Rash Fever with Anxiety
CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮細(xì)胞中的作用①
小兒常見出疹性疾病的診治
患過出疹性疾病的人是否不需要接種麻疹疫苗?
干擾素α-1b治療成人麻疹療效初步觀察
麻疹患者的臨床觀察及護(hù)理
麻疹“卷土重來”