蔡天晶 黎志良 金凌應(yīng) 甘云波

(湖北省通城縣人民醫(yī)院，通城437400)

CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮細(xì)胞中的作用①

蔡天晶 黎志良 金凌應(yīng) 甘云波②

(湖北省通城縣人民醫(yī)院，通城437400)

目的：探討CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮細(xì)胞中的作用。以及CD46和Nectin-4之間的相互作用。方法：分為麻疹病毒感染前處理組和感染后2 h組，均用抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體處理人肺泡上皮細(xì)胞，并設(shè)對(duì)照組。檢測細(xì)胞內(nèi)病毒滴度的變化，采用Western blot和Real-time PCR檢測NP蛋白的表達(dá)水平，并運(yùn)用免疫共沉淀檢測CD46與Nectin-4的相互作用。結(jié)果：與對(duì)照組相比，麻疹病毒感染前用抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體處理的人肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)麻疹病毒滴度顯著降低，分別為對(duì)照組的48.03%和49.53%，同時(shí)用抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體處理使病毒滴度下降為27.15%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。然而，在麻疹病毒感染2 h后用抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體處理，人肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)麻疹病毒滴度和NP蛋白量未見顯著減少。Western blot和Real-time PCR結(jié)果與上述結(jié)果一致；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，CD46與Nectin-4存在相互作用。結(jié)論：CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染肺泡上皮細(xì)胞中起到介導(dǎo)作用，CD46與 Nectin-4可能存在協(xié)同作用，該作用對(duì)麻疹病毒的感染起到了增強(qiáng)效果。

麻疹病毒；人肺泡上皮細(xì)胞；CD46；Nectin-4

麻疹病毒表面有三種受體，分別為人膜輔蛋白(Membrane cofactor protein)CD46、淋巴細(xì)胞表面活化因子(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)以及髓灰質(zhì)炎病毒受體樣蛋白家族(Polio-virus receptor-like proteins，PVRLs)即上皮細(xì)胞表面黏附鏈接蛋白Nectin-4[1]。CD46在人體表達(dá)于除紅細(xì)胞外的有核細(xì)胞上，是較早被發(fā)現(xiàn)的參與麻疹病毒實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株及疫苗株感染的細(xì)胞表面分子[2]。而SLAM介導(dǎo)了野生型麻疹病毒的感染和入侵，SLAM在活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞上均有表達(dá)[3]。Nectin-4廣泛表達(dá)于人胎盤滋養(yǎng)層、胃腺、肺、乳腺及卵巢癌細(xì)胞，在扁桃體、口腔黏膜、食道、鼻咽和器官的柱狀上皮細(xì)胞，以及肺巨噬細(xì)胞也有表達(dá)[4]。在2011年有研究者發(fā)現(xiàn)Nectin-4為麻疹病毒的另一個(gè)受體[5]，麻疹病毒實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株或疫苗株、野生型均可以其作為受體，有助于麻疹病毒進(jìn)出呼吸道。

肺泡上皮細(xì)胞上麻疹病毒受體有CD46和Nectin-4兩種，然而它們?cè)诼檎畈《靖腥痉闻萆掀ぜ?xì)胞中的相關(guān)作用還不清楚。為此，本研究采用分別沉默這兩種細(xì)胞表面的麻疹病毒受體的方法，通過檢測細(xì)胞內(nèi)病毒含量的變化來驗(yàn)證CD46和Nectin-4受體在麻疹病毒侵襲過程中的作用。以及運(yùn)用免疫共沉淀，探討兩種受體之間是否存在相互作用，從而研究麻疹病毒侵襲的可能機(jī)制，為麻疹預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購于美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)；麻疹病毒疫苗株(S191)購于武漢生物制品研究所。

1.1.2 主要試劑 Protein A瓊脂糖珠購于美國Cell Signaling Technology公司；PVDF膜購于美國Millipore公司；ReverTra Ace qPCR RT kit 購于日本TOYOBO公司；BCA蛋白定量試劑盒購于美國Pierce公司；CD46 (D6N7H) Rabbit mAb (#13241)購于美國Cell Signaling Technology公司；Measles NP Antibody(sc-101355)、Nectin-4 Antibody(sc-515093)購于美國Santa Cruz公司；TRIzol reagent、SYBR Select Master Mix購于美國Life Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞接種于96孔板，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到約90%匯合率時(shí)，分別加入梯度稀釋的病毒懸液，用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，在顯微鏡下觀察噬斑并計(jì)數(shù)。

1.2.2 Western blot 獲得的蛋白上清液經(jīng)BCA蛋白定量后，加入還原性上樣緩沖液，95℃，10 min變性；每孔上樣量為80 μg；SDS-PAGE凝膠上電泳，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V。采用濕法轉(zhuǎn)膜，使用PVDF膜，200 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜2 h；用TBS配制的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后孵育一抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜4次，5 min/次，二抗室溫孵育1 h；TBST洗膜4次，5 min/次，顯影。

1.2.3 Real-time PCR 細(xì)胞匯合率約90%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的處理，培養(yǎng)24 h后，用TRIzol reagent裂解液裂解細(xì)胞，并提取細(xì)胞總RNA；使用TECAN酶標(biāo)儀檢測OD值，檢測總RNA的含量以及純度，獲得的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR；按照ReverTra Ace qPCR RT kit說明書體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以獲得的cDNA作為模版，使用SYBR Select Master Mix進(jìn)行Real-time PCR，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；反應(yīng)引物Upstream primer：5′-CATTACATCAGGATCCGG-3′；Downstream primer：5′-GTATTGGTCCGCCTCATC-3′，反應(yīng)體系見表1。

反應(yīng)條件如下：步驟 1:變性；95℃ 30 s。步驟2:反應(yīng)，采集信息；95℃ 5 s；60℃ 40 s 40個(gè)循環(huán)。步驟3:溶解曲線生成；95℃ 15 s；60℃ 60 s；95℃ 15 s；60℃ 15 s。

1.2.4 免疫共沉淀 收集病毒感染24 h后的細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min后，30 000 r/min 4℃離心30 min；獲得的上清液取少量以備Western blot分析，向剩余的上清液中加入1 μg相應(yīng)的抗體，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜；將10 μl Protein A 瓊脂糖珠用適量細(xì)胞裂解液洗滌，3 000 r/min離心3 min，重復(fù)3次；預(yù)處理過的10 μl Protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的上清液中4℃旋轉(zhuǎn)孵育4 h后，4°C，3 000 r/min離心3 min；收集上清液；沉淀用1 ml細(xì)胞裂解液洗滌4次；獲得的瓊脂糖珠沉淀用20 μl裂解液重懸，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件處理所有數(shù)據(jù)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD46和Nectin-4對(duì)S191感染A549細(xì)胞的影響 A549細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，匯合率約90%時(shí)，對(duì)細(xì)胞分別進(jìn)行如下處理：(1)分別加入抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h后，加入麻疹病毒疫苗株(S191)；(2)加入麻疹病毒疫苗株(S191)，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h后加入抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體。對(duì)上述處理的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)噬斑的個(gè)數(shù)。結(jié)果顯示，在病毒感染細(xì)胞前，用抗CD46抗體或抗Nectin-4抗體分別處理的A549細(xì)胞中麻疹病毒滴度顯著減少，為對(duì)照組的48.08%和49.53%，經(jīng)抗CD46抗體及抗Nectin-4抗體共同處理的A549細(xì)胞中，麻疹病毒滴度進(jìn)一步減少，為對(duì)照組的27.15%，如圖1A所示；然而，在病毒感染2 h后，用抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體分別或同時(shí)處理的A549細(xì)胞中，麻疹病毒滴度未見顯著減少，如圖1B所示。

表1 反應(yīng)體系

Tab.1 Reaction system

ReagentDosageSYBRSelectMasterMix(2×)10μlForwardprimer(10μmol/L)0.4μlReverseprimer(10μmol/L)0.4μlcDNAtemplate(5timedilution)2μlDoublesteamingwater7.2μlTotal20μl

圖1 抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體對(duì)麻疹病毒滴度的影響Fig.1 Effection of CD46 antibody resistance and Nectin-4 antibody resistance on measles virus dropsNote: A.The processing results before measles vivus infection;B.The processing results after measles virus infection 2 h.

圖4 CD46和Nectin-4的相互作用Fig.4 Interact with each other of CD46 and Nectin-4

A549細(xì)胞用抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體在麻疹病毒感染前和感染2 h后處理，用Western blot和Real-time PCR試驗(yàn)檢測麻疹病毒NP蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖2和圖3所示，與圖1的結(jié)果保持一致。

2.2 S191感染A549細(xì)胞時(shí)CD46和Nectin-4的相互作用 麻疹病毒感染的A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示，用抗CD46抗體共沉淀得到的復(fù)合物中能檢測到Nectin-4，同樣，用抗Nectin-4抗體共沉淀得到的復(fù)合物中能檢測到CD46。

3 討論

麻疹病毒為具有包膜的、不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，傳染性強(qiáng)，感染人體后急性期癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、畏光、咳嗽、流涕以及全身性紅疹[6]。盡管麻疹疫苗的廣泛使用大大降低了麻疹病毒的傳播和爆發(fā)，但全世界每天仍有約400人因感染麻疹病毒而死亡[6,7]。作為傳染性最強(qiáng)的疾病之一，麻疹在我國仍持續(xù)流行。麻疹病毒也是引起小兒麻疹的病原體，有報(bào)告顯示，中國在2012年和2013年，<8月齡嬰兒在所有年齡段中發(fā)病率最高(分別為13.52/10萬、74.52/10萬)，其次是8～23月齡和2～6歲齡兒童[8]。

本實(shí)驗(yàn)探究了CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中的作用，以及CD46和Nectin-4的相互作用關(guān)系。結(jié)果顯示，在麻疹病毒感染前用抗CD46抗體或抗Nectin-4抗體處理后，A549細(xì)胞中麻疹病毒的表達(dá)量下降，提示封閉CD46或Nectin-4的受體結(jié)合位點(diǎn)，麻疹病毒的感染能力下降。用抗CD46抗體和抗Nectin-4抗體聯(lián)合處理后的A549細(xì)胞，麻疹病毒的感染能力進(jìn)一步下降。該結(jié)果證實(shí)了CD46和Nectin-4有介導(dǎo)麻疹病毒感染A549細(xì)胞的作用。另外，由免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD46和Nectin-4在麻疹病毒感染細(xì)胞的過程中起著協(xié)同作用。然而，在麻疹病毒感染2 h之后，用抗CD46抗體、抗Nectin-4抗體處理，麻疹病毒滴度未有明顯變化。本結(jié)果揭示了麻疹病毒載量減少可能主要是由于進(jìn)入細(xì)胞的病毒減少，而非感染后的復(fù)制能力下降。

細(xì)胞受體是病毒入侵易感細(xì)胞和啟動(dòng)感染的關(guān)鍵。麻疹病毒細(xì)胞受體——膜輔蛋白CD46、SLAM與麻疹病毒血凝素(MV-H)形成復(fù)合體的結(jié)構(gòu)[9,10]；而Nectin-4是近期在上皮細(xì)胞中鑒別的一種受體，可接觸麻疹病毒并幫助其穿過上皮細(xì)胞，在麻疹病毒進(jìn)出人體呼吸道時(shí)起關(guān)鍵作用[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)人類Nectin-4細(xì)胞膜遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域與MV-H形成的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，表明Nectin-4受體結(jié)合位點(diǎn)和其他兩種受體的結(jié)合位點(diǎn)存在廣泛重疊，也就是說該結(jié)合位點(diǎn)代表了抗病毒藥物一個(gè)有潛力的靶點(diǎn)[11]。因此，封閉麻疹病毒的受體結(jié)合位點(diǎn)CD-46和/或Nectin-4，可能阻斷其對(duì)宿主細(xì)胞的結(jié)合和入侵，從而減少對(duì)宿主細(xì)胞的感染和向鄰近細(xì)胞的擴(kuò)散。

本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平對(duì)麻疹病毒受體在病毒感染細(xì)胞的過程進(jìn)行了研究，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步明確，且尚需在動(dòng)物水平上進(jìn)一步的驗(yàn)證本發(fā)現(xiàn)。

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[收稿2016-07-08 修回2016-09-07]

(編輯 倪 鵬)

Role of CD46 and Nectin-4 on Measles virus (MV) infecting human pulmonary alveolar epithelial cells

CAITian-Jing,LIZhi-Liang,JINLing-Ying,GANYun-Bo.

TongchengPeople′sHospitalofHubeiProvince,Tongcheng437400,China

Objective:To investigate the role of CD46 and Nectin-4 on Measles virus (MV) infecting human pulmonary alveolar epithelial cells (HPAEpiC),and the interaction between CD46 and Nectin-4.Methods: Measles virus was divided into pre-infection group and 2 h-infection group,HPAEpiCs treatment with anti-CD46 antibody and/or anti-Nectin-4 antibody as experimental groups,and untreated HPAEpiCs as a control.The variation of viral replication level was detected.A Co-immunoprecipitation assay (Co-IP) was used to explore whether CD46 and Nectin-4 had interactive relationship in MV infection.Results: Compared with the control group,MV titers were reduced in HPAEpiCs of the pre-infection group treated with anti-CD46 and anti-Nectin-4 respectively (48.03% and 49.53%).Furthermore,virus titers showed a more reduction in which treated with anti-CD46 and anti-Nectin-4 antibodies (27.15%,P<0.01).Western blot and Real-time PCR showed that anti-CD46 antibody and anti-Nectin-4 antibodies decreased the rate of MV infection.In the 2 h-infection group,however,the treatment with anti-CD46 and anti-Nectin-4 could significantly reduce the MV titer and NP protein in HPAEpiCs.The Co-IP assay showed that there were interaction between CD46 and Nectin-4.Conclusion: CD46 and Nectin-4 mediated MV infecting HPAEpiCs.Moreover,CD46 and Nectin-4 may play a synergetic role in MV infection,which could enhance the infection effect.

Measles virus；Human pulmonary alveolar epithelial cells；CD46；Nectin-4

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.007

蔡天晶(1963年-)，男，主任醫(yī)師，主要從事心肺疾病及發(fā)病機(jī)制方面的研究，E-mail:caitianjin2016@126.com。

R373.1

A

1000-484X(2017)07-0991-04

①本文為湖北省衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目(No.WJ2015MB301)。

②湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，襄陽441000。