馬 蕾 高梅蘭 舒春梅 于 娟 張玉杰 王忠永 薛海波

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濱州256603)

Notch1信號(hào)通路調(diào)控銀屑病模型小鼠Th17細(xì)胞分化和功能①

馬 蕾 高梅蘭 舒春梅 于 娟 張玉杰 王忠永 薛海波②

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濱州256603)

目的：探討Notch1信號(hào)通路對(duì)銀屑病模型小鼠Th17細(xì)胞分化和功能的調(diào)控作用。方法：以5%咪喹莫特外涂聯(lián)合α-2b干擾素腹腔注射的方法制備20只銀屑病模型小鼠，免疫磁珠分離小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞比例，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt、效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17A、Notch1信號(hào)分子及其靶基因Hes-1的mRNA表達(dá)水平，并與10只對(duì)照組小鼠相比較。將銀屑病模型小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞分為未干預(yù)對(duì)照組和Notch1抑制劑組(γ-分泌酶抑制劑DAPT)，檢測(cè)DAPT阻斷Notch1信號(hào)對(duì)銀屑病模型小鼠Notch1信號(hào)分子及Hes-1、Th17細(xì)胞比例、RORγt及IL-17A表達(dá)水平的影響。結(jié)果：銀屑病模型小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例，RORγt、IL-17A、Notch1及Hes-1的mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照小鼠[分別為(2.97±0.86)%比(0.65±0.11)%，t=15.083；(5.75±0.61)比(1.57±0.43)，t=21.630；(7.83±0.97)比(1.63±0.31)，t=25.348；(7.10±1.37)比(1.47±0.34)，t=17.386；(7.30±1.15)比(1.67±0.48)，t=18.840，P均<0.01]；與未干預(yù)對(duì)照組相比，銀屑病模型小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞各DAPT處理組中Notch1、Hes-1 mRNA表達(dá)水平，Th17細(xì)胞比例、RORγt與IL-17A mRNA表達(dá)水平及培養(yǎng)上清液中IL-17A含量均明顯下降，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為74.368、89.719、126.572、94.558、124.323和123.231，P均<0.01)，且隨DAPT濃度的增加呈劑量依賴性降低。結(jié)論：Notch1信號(hào)通路能夠調(diào)控銀屑病模型小鼠Th17細(xì)胞的分化和功能，對(duì)銀屑病的免疫靶向治療有潛在價(jià)值。

銀屑?。籒otch1；Th17細(xì)胞；IL-17A

銀屑病是一種常見(jiàn)的自身免疫性、炎癥性皮膚病，CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)在銀屑病疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。Th17細(xì)胞是高水平分泌和表達(dá)IL-17A效應(yīng)性細(xì)胞因子的新型CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，參與多種炎癥性、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并在以銀屑病為代表的自身免疫性皮膚病中發(fā)揮重要作用[1-3]。Notch信號(hào)通路是一種高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的分化、發(fā)育過(guò)程中尤其是在T淋巴細(xì)胞分化的命運(yùn)中起關(guān)鍵作用。已有研究表明，在小鼠和人促Th17細(xì)胞分化的細(xì)胞因子環(huán)境中均有Notch1信號(hào)通路的活化[4,5]。本研究以銀屑病模型小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象，采用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch1信號(hào)，探討Notch1對(duì)銀屑病模型小鼠Th17細(xì)胞分化及功能的影響，為銀屑病治療尋找新的免疫靶向藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 6周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠30只，體重(18±2)g，雌鼠15只，雄鼠15只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；5%咪喹莫特乳膏(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司)；3 000 000 U重組人干擾素α-2b注射液(北京凱因科技股份有限公司)；小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞陰性分選試劑盒(挪威Dynal公司)；DATP、佛波酯(PMA)、離子霉素、布雷菲德菌素A(美國(guó)Sigma公司)；重組IL-1β、TGF-β、IL-6、IL-23、抗IFN-γ抗體、抗IL-4抗體以及IL-17A 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)R&D公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD4單克隆抗體、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的IL-17A單克隆抗體(美國(guó)eBioscience公司)；Trizol RNA提取試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；Quantscript RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RealMaster Mix試劑盒(天根生化科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型制備 將30只小鼠隨機(jī)分為銀屑病組20只和對(duì)照組10只，雌雄各半，參考文獻(xiàn)建立銀屑病小鼠模型[6]。小心剃去小鼠背部中央?yún)^(qū)域的被毛，溫和型脫毛膏脫去毳毛，涂以保濕劑備用。將5%咪喹莫特乳膏按50 mg/cm2劑量均勻涂在脫毛部位，10 min后將重組人干擾素α-2b注射液按10 000 U/500 g劑量腹腔內(nèi)注射，1次/d，連續(xù)6 d；對(duì)照組小鼠背部脫毛后僅涂保濕劑，1次/d，連續(xù)6 d。6 d后兩組小鼠均脫臼處死，取脾臟分離CD4+T淋巴細(xì)胞。

1.2.2 小鼠皮膚組織病理檢測(cè) 將小鼠處死后，剪取小鼠的皮膚組織，固定于10%甲醛中，制成石蠟切片，HE染色，觀察銀屑病模型小鼠與對(duì)照小鼠的皮膚組織病理變化。

1.2.3 小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞分離 參考文獻(xiàn)采用陰性分選試劑盒分離小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞[7]，流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估CD4+T淋巴細(xì)胞純度為93.07%±1.86%，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力為94.44%±2.52%。

1.2.4 CD4+T淋巴細(xì)胞分組及干預(yù) 將CD4+T淋巴細(xì)胞分為未干預(yù)對(duì)照組和Notch1抑制劑組(γ-分泌酶抑制劑DAPT)分別接種于12孔板，0.5 ml/孔，細(xì)胞濃度為1×106ml；Notch1抑制劑組以DMSO溶解DAPT，RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整DAPT終濃度分別為2.5、5、10和20 μmol/L，未干預(yù)對(duì)照組為含等量DMSO的RPMI1640培養(yǎng)液；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后收獲細(xì)胞。

1.2.5 CD4+T淋巴細(xì)胞極化 將CD4+T淋巴細(xì)胞置于含有5 μg/ml包被的anti-CD3單克隆抗體及10 μg/ml可溶性anti-CD28單克隆抗體的培養(yǎng)板中，加入Th17細(xì)胞極化刺激因子：10 ng/ml重組IL-1β、2 ng/ml重組TGF-β、30 ng/ml重組IL-6、20 ng/ml重組IL-23以及5 μg/ml抗IFN-γ、5 μg/ml抗IL-4抗體，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)96 h。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞比例(CD4+IL17A+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞×100%) 將CD4+T淋巴細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中調(diào)整濃度至2×106ml，分別加入50 ng/ml PMA、1 μg/ml離子霉素共刺激培養(yǎng)4 h后，按照1∶500比例加入布雷菲德菌素A作用2 h。細(xì)胞膜FITC-CD4單克隆抗體標(biāo)記，透膜、固定后PE-IL17A單克隆抗體胞內(nèi)染色；應(yīng)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)標(biāo)本。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)檢測(cè)IL-17A、RORγt、Notch1及Hes-1的mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取總RNA，Quantscript RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈；設(shè)計(jì)合成IL-17A、RORγt、Notch1、Hes-1及β-actin引物(表1)，采用RealMaster Mix試劑盒于Rotor-Gene 3000 real-time PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量分析法進(jìn)行分析。

1.2.8 ELISA法檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-17A的含量 按照說(shuō)明書(shū)的操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病模型小鼠皮膚組織病理改變 比較銀屑病模型小鼠和對(duì)照小鼠皮膚組織HE病理切片。對(duì)照小鼠的皮膚表皮層較薄，僅由1～2層表皮細(xì)胞構(gòu)成(圖1A、B)；銀屑病模型小鼠表皮層明顯增厚，可見(jiàn)角化過(guò)度和角化不全，部分區(qū)域可見(jiàn)Munro微膿腫，表皮層細(xì)胞數(shù)量增加，表皮突向下延伸，真皮炎細(xì)胞大量浸潤(rùn)(圖1C、D)，與人銀屑病皮損改變基本相同。

2.2 銀屑病模型小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例顯著升高 銀屑病模型小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照小鼠，2.97%±0.68%比0.65%±0.11%，t=15.083，P<0.01(圖2)。

2.3 銀屑病模型小鼠RORγt、IL-17A、Notch1、Hes-1的mRNA水平顯著升高 銀屑病模型小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt及其效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17A的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照小鼠，t值分別為21.630、25.348，P均<0.01(圖3)；Notch1及其靶基因Hes-1的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照小鼠，t值分別為17.386和18.840，P均<0.01(圖3)。

表1 Notch1、Hes-1、IL-17A、RORγt及β-actin引物序列

Tab.1 Primer sequences for Notch1,Hes-1,IL-17A,RORγt and β-actin

NamePrimersequenceLengthofproduct(bp)Notch15'-TGCCAGTATGATGTGGATGAG-3'1115'-GGTCCCTGTGTAACCTTCTGT-3'Hes-15'-AGCCCACCTCTCTCTTCTGA-3'1875'-AGGCGCAATCCAATATGAAC-3'IL-17A5'-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3'1655'-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3'RORγt5'-AGTGTAATGTGGCCTACTCCT-3'1985'-GCTGCTGTTGCAGTTGTTTCT-3'β-actin5'-CCAGCCTTCCTTCTTGGGTAT-3'1025'-TTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3'

圖1 銀屑病模型小鼠與對(duì)照小鼠皮膚組織病理改變(HE，×200)Fig.1 Pathological changes in skin tissues of murine psoriasis model and control mouse(HE，×200)Note: A，B.Control mouse；C，D.Murine psoriasis model.

圖2 銀屑病模型小鼠與對(duì)照小鼠FITC-CD4、PE-IL17A染色流式細(xì)胞圖Fig.2 FITC-CD4 and PE-IL17A flow cytometry staining of murine psoriasis model vs control mouseNote: A.Control mouse；B.Murine psoriasis model.

圖3 銀屑病模型小鼠與對(duì)照小鼠CD4+ T淋巴細(xì)胞中RORγt、IL-17A、Notch1、Hes-1的mRNA表達(dá)水平Fig.3 mRNA expression levels of RORγt,IL-17A,Notch1 and Hes-1 in CD4+ T lymphocytes of murine psoriasis model vs.control mouse

表2 DAPT對(duì)銀屑病模型小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞Notch1、Hes-1 mRNA表達(dá)水平的影響

Tab.2 Effect of DAPT on Notch1 and Hes-1 mRNA expression in CD4+T lymphocytes of murine psoriasis model

mRNAexpressionlevelsControl2.5μmol/LDAPT5μmol/LDAPT10μmol/LDAPT20μmol/LDAPTFPNotch11.23±0.290.85±0.050.61±0.050.44±0.040.30±0.0574.368<0.01Hes-11.18±0.210.90±0.090.64±0.060.48±0.060.38±0.0389.719<0.01

表3 DAPT對(duì)銀屑病模型小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞Th17細(xì)胞比例、RORγt與IL-17A mRNA表達(dá)水平、培養(yǎng)液上清中IL-17A含量的影響

Tab.3 Effect of DAPT on Th17 cell percentage,RORγt and IL-17A mRNA,and IL-17A concentration in cell-free supernatant in CD4+T lymphocytes of murine psoriasis model

ExpressionlevelsControl2.5μmol/LDAPT5μmol/LDAPT10μmol/LDAPT20μmol/LDAPTFPTh17cellpercentage(%)7.25±1.076.05±0.923.68±0.781.96±0.360.98±0.21126.572<0.01RORγtmRNA1.17±0.190.84±0.060.64±0.050.53±0.040.44±0.0594.558<0.01IL-17AmRNA1.32±0.190.84±0.040.66±0.080.53±0.060.43±0.03124.323<0.01IL-17Aconcentration76.61±9.3658.77±7.6241.75±5.6935.36±2.6320.75±2.14123.231<0.01

圖4 銀屑病模型小鼠CD4+ T淋巴細(xì)胞不同濃度DAPT組與未干預(yù)對(duì)照組間Notch1、Hes-1 mRNA表達(dá)Fig.4 mRNA expression of Notch1 and Hes-1 among DAPT groups and control group in CD4+ T lymphocytes of murine psoriasis model

圖5 銀屑病模型小鼠CD4+ T淋巴細(xì)胞不同濃度DAPT組與未干預(yù)對(duì)照組間Th17細(xì)胞比例、RORγt與IL-17A mRNA表達(dá)水平、培養(yǎng)液上清中IL-17A含量Fig.5 Expression levels of Th17 cell percentage,RORγt and IL-17A mRNA,and IL-17A concentration in cell-free supernatant among DAPT groups and control group in CD4+ T lymphocytes of murine psoriasis model

2.4 DAPT抑制銀屑病模型小鼠Notch1、Hes-1的表達(dá) 體外培養(yǎng)銀屑病模型小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞，以γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)處理細(xì)胞，DAPT各處理組Notch1及其靶基因Hes-1的mRNA表達(dá)水平均較未干預(yù)對(duì)照組(DMSO組)顯著降低，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為74.368和89.719，P均<0.01)，且隨DAPT作用濃度的增加，Notch1與Hes-1的mRNA表達(dá)水平呈劑量依賴性降低(表2，圖4)。

2.5 DAPT下調(diào)銀屑病模型小鼠Th17細(xì)胞比例及RORγt、IL-17A的表達(dá)與分泌 體外培養(yǎng)銀屑病模型小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞，以γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)處理細(xì)胞，與未干預(yù)對(duì)照組(DMSO組)相比，DAPT各處理組中Th17細(xì)胞比例、Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt及效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17A mRNA表達(dá)水平、培養(yǎng)上清液中IL-17A含量均明顯下降，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Th17細(xì)胞比例F=126.572；RORγt mRNAF=94.558；IL-17A mRNAF=124.323；IL-17A含量F=123.231，P均<0.01)，且隨DAPT作用濃度的增加，上述指標(biāo)表達(dá)水平呈劑量依賴性降低(表3，圖5)。

3 討論

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性、復(fù)發(fā)性、自身免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，發(fā)病率為2%～3%[8]。CD4+T淋巴細(xì)胞活性異常對(duì)銀屑病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸發(fā)揮重要作用，銀屑病皮損組織中大量的T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子形成異常的免疫微環(huán)境，導(dǎo)致表皮角質(zhì)細(xì)胞異常分化[1,2]；Th17細(xì)胞是以分泌IL-17A為特點(diǎn)的新型CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，RORγt是其特異性轉(zhuǎn)錄因子，IL-17A與IL-17A受體結(jié)合作用于靶細(xì)胞，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，觸發(fā)炎癥遞質(zhì)釋放，進(jìn)而在炎癥性及自身免疫性疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9,10]。Th17細(xì)胞在以銀屑病為代表的自身免疫性皮膚病中發(fā)揮重要作用，銀屑病患者外周血中Th17細(xì)胞比例、RORγt及IL-17A表達(dá)水平均明顯增高，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，以5%咪喹莫特外涂聯(lián)合α-2b干擾素腹腔注射制備銀屑病模型小鼠顯示其皮膚組織病理改變與人銀屑病病理改變基本相同，銀屑病模型小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞及其特異性轉(zhuǎn)錄因子、效應(yīng)性細(xì)胞因子均顯著增高，進(jìn)一步說(shuō)明該模型是目前銀屑病Th17細(xì)胞相關(guān)研究的理想模型[12,13]。

T淋巴細(xì)胞的分化受多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控，Notch信號(hào)在T淋巴細(xì)胞的增殖、分化及功能調(diào)節(jié)方面均具有重要的作用[4,14]。Notch信號(hào)通路由Notch受體(Notch1-Notch4)、Notch配體(Delta-like 1、3、4，Jagged 1、2)、CSL(CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱(chēng))DNA結(jié)合蛋白、其他的效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等組成。Notch配體與相鄰細(xì)胞的Notch受體結(jié)合后，將在Notch受體分子的S2和S3兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生連續(xù)切割，S3被依賴早老素(PS)包含γ-分泌酶的復(fù)合物切割后，釋放出具有核定位信號(hào)的胞質(zhì)區(qū)(Notch intracellular domain,NICD)，NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核激活靶基因(如Hes)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。γ-分泌酶抑制劑DAPT能夠作用于PS分子而阻斷γ-分泌酶的作用，減少NICD的產(chǎn)生，下游信號(hào)分子由于缺少或減少NICD的啟動(dòng)作用而處于靜止或下調(diào)狀態(tài)[15,16]。有研究表明Notch1信號(hào)分子在銀屑病皮損組織中高表達(dá)，并參與了角質(zhì)形成細(xì)胞的分化調(diào)控[17,18]。本研究結(jié)果顯示，Notch1信號(hào)分子及其靶基因Hes-1在銀屑病模型小鼠CD4+T細(xì)胞中均明顯高表達(dá)，表明Notch1信號(hào)分子參與銀屑病的疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明在小鼠促Th17分化的細(xì)胞因子環(huán)境中有Notch1信號(hào)分子的活化，阻斷Notch1信號(hào)通路則明顯下調(diào)Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕Th17細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17A介導(dǎo)的炎癥，Notch1亦能調(diào)控Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)[5,19]。本研究結(jié)果顯示γ-分泌酶抑制劑DAPT能夠劑量依賴性降低銀屑病模型小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞中Notch1信號(hào)分子及其靶基因Hes-1、Th17細(xì)胞及其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt、效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17A的表達(dá)與分泌，表明Notch1信號(hào)分子能夠發(fā)揮對(duì)銀屑病Th17細(xì)胞分化的調(diào)控作用。銀屑病患者外周血及皮損組織中、銀屑病模型小鼠脾臟、外周血及皮損組織中Th17細(xì)胞及其效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17A均呈高表達(dá)狀態(tài)，且與疾病活動(dòng)度、嚴(yán)重程度相關(guān)[11,20,21]，表明脾臟、外周循環(huán)與皮損組織中Th17細(xì)胞的功能狀態(tài)具有一定的相關(guān)性。以銀屑病模型小鼠脾臟分離CD4+T淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象探討Notch1信號(hào)對(duì)Th17細(xì)胞的調(diào)控能夠在一定程度上反映皮損組織中Th17細(xì)胞的變化和功能狀態(tài)，高表達(dá)的Notch1信號(hào)分子能夠通過(guò)促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和功能增強(qiáng)進(jìn)而介導(dǎo)銀屑病的炎癥反應(yīng)過(guò)程。

因此， Notch1信號(hào)通過(guò)調(diào)控Th17細(xì)胞的分化和功能在銀屑病疾病過(guò)程中發(fā)揮作用；阻斷Notch1信號(hào)通路，減輕Th17細(xì)胞在銀屑病中的致炎效應(yīng)，為銀屑病的免疫靶向治療提供了思路。

[1] 王 英，王麗麗，韓 朔.CD4+T淋巴細(xì)胞亞群與銀屑病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2016,32(6):834-836.

[2] Nograles KE,Zaba LC,Guttman-Yassky E,etal.Th17 cytokines interleukin (IL)-17 and IL-22 modulate distinct inflammatory and keratinocyte-response pathways[J].Br J Dermatol,2008,159(5):1092-1102.

[3] Fotiadou C,Lazaridou E,Sotiriou E,etal.IL-17AA,IL-22,and IL-23 as markers of psoriasis activity:a cross-sectional,hospital-based study[J].J Cutan Med Surg,2015,19(6):555-560.

[4] Amsen D,Helbig C,Backer RA.Notch in T Cell Differentiation:All Things Considered[J].Trends Immunol,2015,36(12):802-814.

[5] Keerthivasan S,Suleiman R,Lawlor R,etal.Notch signaling regulates mouse and human Th17 differentiation[J].J Immunol,2011,187(2):692-701.

[6] 董穎穎，鐘世玉，王 瓊，等.銀屑病小鼠模型建立的新方法[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2016,30 (11):1127-1131.

[7] 聶 穎，楊邦坤，盛安群，等.PI3K和Notch信號(hào)通路對(duì)哮喘小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞活化及增殖的協(xié)同調(diào)控作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2013,93(44):3532-3536.

[8] Christophers E.Psoriasis-epidemiology and clinical spectrum[J].Clin Exp Dermatol,2001,26(4):314-320.

[9] Bettelli E,Oukka M,Kuchroo VK.T(H)-17 cells in the circle of immunity and autoimmunity[J].Nat Immunol,2007,8(4):345-350.

[10] Toussirot E.The IL23/Th17 pathway as a therapeutic target in chronic inflammatory diseases[J].Inflamm Allergy Drug Targets,2012,11(2):159-168.

[11] 陳永鋒，常樹(shù)霞，鄭道城.尋常性銀屑病患者外周血和皮損中Th17細(xì)胞及相關(guān)因子的表達(dá)[J].中華皮膚科雜志,2011,44 (1):11-14.

[12] Flutter B,Nestle FO.TLRs to cytokines:mechanistic insights from the imiquimod mouse model of psoriasis[J].Eur J Immunol,2013,43(12):3138-3146.

[13] Alunno A,Carubbi F,Cafaro G,etal.Targeting the IL-23/IL-17A axis for the treatment of psoriasis and psoriatic arthritis[J].Expert Opin Biol Ther,2015,15(12):1727-1737.

[14] Amsen D,Antov A,Flavell RA.The different faces of Notch in T-helper-cell differentiation[J].Nat Rev Immunol,2009,9(2):116-124.

[15] Morohashi Y,Kan T,Tominari Y,etal.C-terminal fragment of presenilin is the molecular target of a dipeptidic gamma-secretase-specific inhibitor DAPT (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) [J].J Biol Chem,2006,281(21):14670-14676.

[16] Geling A,Steiner H,Willem M,etal.A gamma-secretase inhibitor blocks Notch signaling in vivo and causes a severe neurogenic phenotype in zebrafish[J].EMBO Rep,2002,3(7):688-694.

[17] Rooney P,Connolly M,Gao W,etal.Notch-1 mediates endothelial cell activation and invasion in psoriasis[J].Exp Dermatol,2014,23(2):113-118.

[18] Ota T,Takekoshi S,Takagi T,etal.Notch signaling may be involved in the abnormal differentiation of epidermal keratinocytes in psoriasis[J].Acta Histochem Cytochem,2014,47(4):175-183.

[19] Mukherjee S,Schaller MA,Neupane R,etal.Regulation of T cell activation by Notch ligand,DLL4,promotes IL-17A production and Ror cactivation[J].J Immunol,2009,182(12):7381-7388.

[20] 趙京霞，底婷婷，王 燕，等. IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用[J].中國(guó)病理生理雜志,2013,29 (6):1086-1094.

[21] Lowes MA,Kikuchi T,Fuentes-Duculan J,etal.Psoriasis vulgaris lesions contain discrete populations of Th1 and Th17 T cells[J].J Invest Dermatol,2008,128(5):1207-1211.

[收稿2017-02-17 修回2017-05-03]

(編輯 張曉舟)

Notch1 signaling pathway regulates Th17 cell differentiation and function in murine psoriasis model

MALei,GAOMei-Lan,SHUChun-Mei,YUJuan,ZHANGYu-Jie,WANGZhong-Yong，XUEHai-Bo.

BinzhouMedicalUniversityHospital,Binzhou256603,China

Objective:To determine the effect of Notch1 signaling pathway on the differentiation and function of Th17 cells in murine psoriasis model.Methods: BALB/c mice were randomly divided into psoriasis model group and control group.Murine psoriasis model was established by topical 5% imiquimod application in combination with intraperitoneal injection of α-2b interferon.The CD4+T lymphocytes were isolated by magnetic activated cell sorter (MACS).Flow cytometric analysis (FCM) was performed to detect the percentage of Th17 cells.Real-time RT-PCR was employed to measure the mRNA levels of RORγt,IL-17A,Notch1 and Hes-1.The CD4+T lymphocytes were then divided into γ-secretase inhibitor DAPT groups and control group,and the expression differences of Notch1 signaling molecule and its target gene Hes-1 mRNA levels,Th17 cell percentage,RORγt and IL-17A mRNA levels,and IL-17A concentrations in cell-free supernatant were detected.Results: The expression levels of Th17 cell percentage and RORγt,IL-17A,Notch1 and Hes-1 mRNA in CD4+T lymphocytes of murine psoriasis model were significantly higher than control mouse[(2.97±0.86)% vs.(0.65±0.11)%,t=15.083;(5.75±0.61) vs.(1.57±0.43),t=21.630;(7.83±0.97) vs.(1.63±0.31),t=25.348;(7.10±1.37) vs.(1.47±0.34),t=17.386;(7.30±1.15) vs.(1.67±0.48),t=18.840,respectively,allP<0.01].Compared with control group,Th17 cell percentage,mRNA expression levels of Notch1,Hes-1,RORγt and IL-17A,and IL-17A concentrations in cell-free supernatant from cultured CD4+T lymphocytes of murine psoriasis model were dramatically decreased in DAPT treated groups in a dose-dependent way (F=74.368,89.719,126.572,94.558,124.323 and 123.231 respectively,allP<0.01).Conclusion: Notch1 signaling pathway can regulate the differentiation and function of Th17 cells in murine psoriasis model,and may have potential value for the target immunotherapy of psoriasis.

Psoriasis;Notch1;Th17 cells;IL-17A

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.006

①本文受山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2016WS0045)資助。

馬 蕾(1978年-)，女，博士，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事皮膚病的分子免疫研究，E-mail：doctor_malei@126.com。

R75

A

1000-484X(2017)07-0985-06

②通訊作者，E-mail：xuehaibo@sina.com。