于一云 付思思 劉 磊 楊 潔 韓 磊 呂 玲

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕科,上海200040)

瘦素通過NLRP3炎性體對小鼠骨髓樹突狀細胞的作用及機制①

于一云 付思思②劉 磊 楊 潔 韓 磊③呂 玲

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕科,上海200040)

目的：探討瘦素通過NLRP3炎性體對樹突狀細胞的作用及其機制。方法：體外誘導(dǎo)小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(BMDCs)，用不同濃度瘦素與BMDCs共同培養(yǎng)，分別檢測培養(yǎng)上清IL-1β和IL-18的蛋白和基因水平，用FLICA試劑盒或ROS試劑盒分別在流式細胞儀上檢測caspase-1活性或胞內(nèi)ROS生成情況。瘦素與BMDCs共培養(yǎng)，加入caspase-1抑制劑或用siRNA干擾NLRP3基因表達，檢測前后加入IL-1β和IL-18基因和蛋白表達水平。瘦素與BMDCs共培養(yǎng)，加入ROS抑制劑或KCL，檢測加入前后IL-1β和IL-18蛋白分泌水平。結(jié)果：瘦素促進BMDCs分泌IL-1β和IL-18。瘦素通過上調(diào)NLRP3基因促進IL-1β和IL-18基因和蛋白表達，通過激活caspase-1蛋白提高IL-1β基因和蛋白水平，K+外流參與此過程。 結(jié)論：瘦素通過激活NLRP3炎性體促進BMDCs IL-1β和IL-18基因和蛋白表達，此過程部分通過K+外流實現(xiàn)。這提示瘦素可能是NLRP3炎性體的激活劑。

瘦素；NLRP3炎性體；樹突狀細胞；細胞因子

NLRP3，又名 NLAP3，與銜接蛋白 ASC 和效應(yīng)蛋白 caspase-1 共同構(gòu)成NLRP3 炎性體。NLRP3 炎性體是目前發(fā)現(xiàn)的配體最多的炎性體，可以被外源性病原微生物及內(nèi)源性晶體、尿酸、dsDNA、ATP 等激活[1,2]，各種配體主要通過3種方式激活 NLRP3 炎性體:細胞內(nèi) K+外流、ROS的產(chǎn)生和溶酶體破裂[2,3]。NLRP3 炎性體激活最終導(dǎo)致caspase-1 的活化從而促進炎癥細胞因子 IL-1β、IL-18 的分泌而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[4]。NLRP3 主要在包括單核-巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)等髓系細胞中表達，但是最近多篇研究報道Th1、Th2、Th17均可表達NLRP3[5-7]。因為NLRP3炎性體與多種疾病，包括Muckle-Wells綜合征、阿爾茨海默病、2型糖尿病，以及實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病相關(guān)，大量研究致力于闡明NLRP3炎性體在各種疾病中的作用及其機制[7-11]。

瘦素是脂肪細胞分泌的細胞因子樣激素，其最基本的功能是控制代謝和能量輸出，但是近來大量研究發(fā)現(xiàn)瘦素也可調(diào)節(jié)固有或適應(yīng)性免疫應(yīng)答。瘦素不僅促進NK細胞活化、中性粒細胞趨化、巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6和IL-12[12]，而且促進Th17應(yīng)答[13]和下調(diào)Treg水平[14]。NAG-1小鼠WAT中caspase-1和ASC在基因和蛋白水平顯著下降，同時伴隨IL-18、IL-1β和瘦素水平下降[15]，這提示瘦素和NLRP3炎性體可能存在某種相關(guān)。這里我們報道瘦素通過K+外流激活小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)NLRP3炎性體進而促進IL-1β和IL-18分泌，這表明瘦素是NLRP3炎性體的一種新的激活劑而且可以作為NLRP3炎性體的調(diào)節(jié)劑。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 野生型 C57BL/6J(B6)小鼠6～8周齡，購于上海斯萊克公司；RPMI1640和胎牛血清購于Gibco；瘦素、GM-CSF和IL-4購于Pepro Tech；Ac-YVAD-cmk、KCl 均購于Sigma；caspase-1 FLICA試劑盒購于Immunochemistry；ROS檢測試劑盒購于Abcam；CD11c流式抗體購于Biolegend；ELISA試劑盒購于R&D system或科諾迪生物科技有限公司；Trizol購于Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa，Real-time PCR試劑盒購于Biotool；引物由生工生物工程公司合成；siRNA由拓然生物公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠BMDCs細胞的體外誘導(dǎo)和培養(yǎng) 無菌取B6小鼠的骨髓細胞，懸于RPMI1640 完全培養(yǎng)基中，加入GM-CSF 20 ng/ml，IL-4 15 ng/ml，37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。第4天輕晃培養(yǎng)皿，吸去培養(yǎng)上清，以去除未貼壁細胞。補充RPMI1640完全培養(yǎng)基至原來體積，補充GM-CSF 20 ng/ml，IL-4 15 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)。第7 天，重復(fù)第4 天的步驟。第10 天，輕柔地吹打皿底細胞，收集細胞懸液，離心洗滌。收獲的細胞為普通未成熟DC 細胞(iDC)。若第9 天加入LPS 100 ng/ml 促成熟，第10天收獲的細胞即為普通成熟DC 細胞(mDC)。使用CD11c流式抗體檢測BMDCs的純度，顯微鏡下觀察BMDCs的形態(tài)。

1.2.2 小鼠BMDCs處理 分組如下:正常對照組，LPS組，ATP組，LPS+ATP組，不同劑量瘦素組(10、100、500 ng/ml)。其中瘦素與小鼠BMDCs共培養(yǎng)24 h，ATP、LPS、LPS+ATP分別與BMDCs共培養(yǎng)3 h，之后分別加入Ac-YVAD-cmk(18.4 μmol/L)或NLRP3 siRNA(20 μmol/L)或KCL(100 μmol/L)，取共培養(yǎng)上清或細胞沉淀行下一步試驗。

1.2.3 細胞因子檢測 ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-18的水平。實驗步驟按照說明書進行。

1.2.4 RNA提取、cDNA合成和實時定量PCR 根據(jù)說明書用Trizol試劑提取細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。實時熒光定量PCR在ABI Prism 7500 PCR上用SYBR green master mix進行。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。所有基因表達量以GAPDH計算。所用引物序列如下:NLRP3-F：ATTACCCGCCCGAGAAAGG,NLRP3-R：CATGAGTGTGGCTAGATCCAAG；IL-1β-F:GTACAA-GGAGAACCAAGCAA，IL-1β-R:CCGTCTTTCATTACACAGGA；IL-18-F:AGGACACTTTCTTGCTTGC-C,IL-18-R:CACAAACCCTCCCCACCTAA。

1.2.5 流式細胞分析 體外誘導(dǎo)獲得小鼠BMDCs后標(biāo)記CD11c抗體檢測BMDCs的純度。不同濃度的瘦素(10、100、500 ng/ml)與小鼠BMDCs共培養(yǎng)24 h，用FLICA試劑盒檢測caspase-1活性，用ROS檢測試劑盒檢測BMDCs ROS合成，THBP作為陽性對照。實驗步驟按照說明書在流式細胞儀上進行。

1.2.6 siRNA轉(zhuǎn)染 20 μmol/L NLRP3特異siRNA轉(zhuǎn)染小鼠BMDCs細胞，使用Lipofectamin 2000按照說明書進行。6 h后轉(zhuǎn)染細胞與不同濃度的瘦素(10、100、500 ng/ml)共培養(yǎng)24 h。熒光顯微鏡下觀察紅色熒光細胞轉(zhuǎn)染表達情況，用實時熒光定量PCR分析NLRP3基因敲除的效果，所用引物序列如下:NLRP3-F：ATTACCCGCCCGAGAAAGG,NLRP3-R：CATGAGTGTGGCTAGATCCAAG。

2 結(jié)果

2.1 瘦素促進小鼠BMDCs IL-1β和IL-18分泌 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMDCs狀態(tài)佳，純度90%左右(圖1)。為了研究瘦素對小鼠BMDCs細胞的作用，不同濃度的瘦素(10、100、500 ng/ml)加入小鼠BMDCs共培養(yǎng)24 h，以LPS+ATP作為陽性對照。收集細胞上清或細胞沉淀行ELISA或RT-PCR。結(jié)果證明高濃度瘦素(500 ng/ml)在基因和蛋白水平均促進小鼠BMDCs IL-1β(圖2A、C)和IL-18(圖2B、D)表達，尤其對IL-1β的基因促進作用更明顯(P<0.001)，瘦素100 ng/ml也可增強IL-1β基因表達(P<0.05)(圖2C)。

2.2 瘦素激活caspase-1促進小鼠BMDCs IL-1β分泌而對IL-18無明顯影響 IL-1β和IL-18前體水解成有活性的 IL-1β和IL-18，是IL-1β和IL-18合成和分泌的關(guān)鍵一步，這一步是通過NLRP3炎性體的組成部分caspase-1實現(xiàn)的[16,17]。因為瘦素促進小鼠BMDCs IL-1β和IL-18分泌，接下來我們探討瘦素對caspase-1的作用。以LPS+ATP為陽性對照，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，瘦素呈劑量依賴的關(guān)系增強caspase-1活性(圖3A、B)，用caspase-1抑制劑Ac-YVAD-cmk抑制caspase-1活性，IL-1β在基因和蛋白水平均有降低(圖3C、D)，而IL-18水平無明顯變化(圖3E)。

2.3 瘦素上調(diào)NLRP3基因表達促進小鼠BMDCs分泌IL-1β和IL-18 如前所述，NLRP3炎性體由NLRP3、ASC和caspase-1組成。瘦素可促進BMDCs分泌IL-1β和IL-18，而抑制caspase-1降低了瘦素引起的升高的IL-1β而對IL-18無明顯作用，我們試圖探討瘦素對NLRP3的影響及抑制NLRP3對IL-1β和IL-18的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度瘦素(500 ng/ml)可上調(diào)小鼠BMDCs NLRP3基因表達(圖4A)，用siRNA干擾NLRP3表達，并于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果(圖4B)，高濃度瘦素引起的升高的IL-1β(圖4C、D)和IL-18(圖4E)也隨之下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(BMDCs)純度及形態(tài)Fig.1 Purity and morphology of BMDCs from mouseNote: A.Purity of BMDCs induced invitro by flow cytometry;B.Morphology of BMDCs under light microscope.

圖2 瘦素促進BMDCs IL-1β和IL-18表達Fig.2 Leptin promotes IL-1β and IL-18 secretion in BMDCsNote: IL-1β(A) or IL-18(B) ELISA of culture supernatant from BMDCs incubated with LPS,ATP,LPS+ATP(L+A),or leptin at scalar doses(10 ng/ml,100 ng/ml,500 ng/ml)for 24 hours.Results are expressed as ng/ml and are means±SEM from four independent experiments. Relative mRNA level of pro-IL-1β(C) or IL-18(D) in BMDCs treated as above. Results are from three independent experiments.*.P<0.05, **.P<0.01,***.P<0.001.

2.4 K+外流參與瘦素引起的小鼠BMDCs IL-1β和IL-18升高 ROS是促進NLRP3炎性體激活的一種方式[18,19,20]。我們用流式細胞儀檢測了不同濃度瘦素干預(yù)小鼠BMDCs后的ROS生成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度瘦素對ROS生成并沒有明顯影響(圖5A、B)。

K+外流是促進NLRP3炎性體激活的另一種方式[21]。我們用不同濃度瘦素與100 mmol/L KCl共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)加入KCl抑制K+外流后高濃度瘦素引起的升高的IL-1β(圖5C)和IL-18(圖5D)水平明顯下降。

圖3 瘦素促進BMDCs的caspase-1活化并分泌IL-1βFig.3 Caspase-1 activation facilitates IL-1β secretion in response to leptinNote: Caspase-1 activity was measured by intracellular FLICA staining in BMDCs incubated with LPS,ATP,LPS+ATP(L+A),or leptin at scalar doses(10 ng/ml,100 ng/ml,500 ng/ml)for 24 hours.Representative (A) and cumulative (B) data are from three experiments；C.ELISA of IL-1β inculture supernatant from BMDCs in the presence or absence of caspase-1 inhibitor Ac-YVAD-cmk(20 μmol/L) for 24 hours,results are expressed as ng/ml and are means±SEM from four independent experiments.Relative mRNA level of IL-1β(D) and IL-18(E) in BMDCs treated as in panel C.Results are from three independent experiments.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖4 瘦素上調(diào)BMDCs的NLRP3基因表達并分泌IL-1β和IL-18

Fig.4 NLRP3 up-regulation encourages IL-1β and IL-18 expression in response to leptin

Note: A. Relative mRNA level of NLRP3 in BMDCs incubated with LPS+ATP or leptin at scalar doses(10 ng/ml,100 ng/ml,500 ng/ml) for 24 hours；B.BMDCs nucleofected by NLRP3 specific siRNA carrying fluorescence and observed under fluorescence microscope；C.Relative mRNA level of NLRP3 in BMDCs after nucleofected with NLRP3 specific siRNA. IL-1β(D) or IL-18(E) ELISA of culture supernatant from BMDCs treated as inpanel C.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖5 K+外流參與瘦素引起的NLRP3炎性體活化并促進IL-1β和IL-18分泌Fig.5 K+ efflux is involved in producing IL-1β and IL-18 in response to leptinNote: A.Flow cytometric analysis of ROS in BMDCs incubated with leptin at scalar doses(10 ng/ml,100 ng/ml,500 ng/ml) for 24 hours.Using THBP as positive control.Representative data from three independent experiments；B. Cumulative data of ROS in BMDCs(treated as in panel A) from three experiments.IL-1β(C) or IL-18 (D) ELISA of culture supernatants from BMDCs incubated with leptin at scalar doses(10 ng/ml,100 ng/ml,500 ng/ml) for 24 hours in the presence or absence of KCl(100 mmol/L).*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

3 討論

在這篇文章中我們發(fā)現(xiàn)瘦素在基因和蛋白水平促進小鼠BMDCs細胞分泌IL-1β和IL-18。之前一些研究報道:瘦素增加人外周血單個核細胞IL-1β釋放，增強了人骨髓來源的DC細胞IL-1β的基因和蛋白表達水平[22]。瘦素促進牛外周血單個核細胞IL-1β分泌，但是對IL-1β的mRNA并沒有影響[23]。而有些研究也發(fā)現(xiàn)瘦素促進人單核細胞分泌IL-18而對IL-1β并沒有作用[24]，甚至我們也發(fā)現(xiàn)瘦素可促進小鼠RAW264.7細胞IL-18分泌而不是IL-1β分泌(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。IL-1β基因是IL-1細胞因子家族中最重要的一員，組織缺氧、微生物感染、 創(chuàng)傷等外界因素可以誘導(dǎo)多種細胞表達 IL-1β，包括單核、巨噬細胞、DC細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)形成細胞、系膜細胞以及人類腫瘤細胞，這些細胞被激活以后首先合成IL-1β 的前體，存在于胞漿中，沒有活性。隨后在IL-1β轉(zhuǎn)換酶如caspase-1的作用下，產(chǎn)生成熟 IL-1β，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。實際上，雖然IL-1β和IL-18同是IL-1細胞因子家族，在結(jié)構(gòu)和受體利用上非常相似，但是兩者在表達、合成和加工方面并不相同[25-27]。李斯特菌產(chǎn)單核細胞(Lm)60蛋白是NLRP3炎性體非經(jīng)典的激活劑，IL-1β和IL-18的產(chǎn)生是獨立調(diào)節(jié)的，表明樹突狀細胞NLRP3炎性體產(chǎn)生IL-1β或IL-18需要完全不同的條件[28]?？赡芩柘得庖呒毎欠駥κ菟赜袘?yīng)答及何種應(yīng)答取決于細胞來源的種系及細胞分化的階段。

我們發(fā)現(xiàn)瘦素上調(diào)NLRP3基因表達促進IL-1β和IL-18分泌而抑制caspase-1僅降低了IL-1β分泌而對IL-18無明顯影響。盡管caspase-1是NLRP3炎性體的經(jīng)典表現(xiàn)形式，但是近來caspase-8被鑒定為髓系細胞中的非經(jīng)典炎性caspase，而且也可以產(chǎn)生IL-1β前體。Martin等[7]剛剛報道ATP 可誘導(dǎo)極化的Th17細胞表達IL-1受體，通過NLRP3和ASC依賴的方式活化caspase-8產(chǎn)生成熟IL-1β。據(jù)此我們推測瘦素可能通過caspase-8依賴的方式促進BMDCs產(chǎn)生IL-18，在今后的工作中我們將進一步驗證。

目前ROS生成、K+外流和溶酶體破裂是NLRP3激活的三種主要方式。我們發(fā)現(xiàn)加入KCl抑制BMDCs K+外流可使高濃度瘦素引起的升高的IL-1β和IL-18水平下降，說明K+外流參與瘦素引起的小鼠BMDCs IL-1β和IL-18升高。遺憾的是，我們發(fā)現(xiàn)瘦素對BMDCs的ROS生成并沒有明顯影響。可能瘦素少量誘發(fā)細胞凋亡，因此作為細胞凋亡的代謝產(chǎn)物-ROS生成變化不大，所以并不參與這一機制。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)瘦素通過K+外流激活NLRP3炎性體促進小鼠BMDCs分泌IL-1β和IL-18，這提示瘦素可能是NLRP3炎性體的激活劑，今后可作為抗微生物和抗炎治療的靶點。

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[收稿2017-03-09]

(編輯 張曉舟)

Impact and mechanism of leptin on bone marrow-derived dendritic cells(BMDCs)via NLRP3 inflammasome

YUYi-Yun,FUSi-Si,LIULei,YANGJie,HANLei,LüLing.

DivisionofRheumatology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China

Objective:To investigate the role and mechanism of leptin on dendritic cells by NLRP3 inflammasome.Methods: BMDCs were induced in vitro，leptin with scalar doses was cocultured with BMDCs，IL-1β and IL-18 mRNA expression and protein secretion level were measured by q-RT-PCR and ELISA respectively.Caspase-1 activity or ROS synthesis were tested with FLICA kit or ROS detection assay kit on flow cytometry.IL-1β or IL-18 were detected after caspase-1 was inhibited by Ac-YVAD-cmk or NLRP3 was interfered by siRNA or ROS inhibitor DPI or KCL were added.Results: Leptin promoted secretion of IL-1β and IL-18.Leptin up-regulated NLRP3 and activted caspase-1 to secret proinflammtory cytokine，which K+efflux took part in.Conclusion: Leptin promotes secretion of IL-1β and IL-18 by activating NLRP3 inflammasome，and K+efflux takes part in this，which hints us that leptin may be an activator of NLRP3 inflammasome.

Leptin;NLRP3 inflammasome;Dendritic cells;Cytokine

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.003

①本文受國家自然科學(xué)基金項目(81401345)和復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院青年醫(yī)師培養(yǎng)計劃資助。

于一云(1981年-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事系統(tǒng)性紅斑狼瘡、痛風(fēng)、硬皮病等方面的研究，E-mail：13788978206@163.com。

及指導(dǎo)教師：呂 玲(1964年-)，女，博士，教授，主要從事自身免疫性疾病的研究，E-mail：huashanlvling@sina.com。

R392

A

1000-484X(2017)07-0971-05

②共同第一作者。

③上海市血液中心血液工程學(xué)科，上海200051。