鄒 凱 云小樂 康鴻斌 王 雪 張曉慧 謝基明 王玉珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

Rab7基因沉默對巨噬細胞中R848激活的細胞因子及MAPK信號通路影響①

鄒 凱 云小樂 康鴻斌②王 雪 張曉慧 謝基明③王玉珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

目的：本實驗闡述了Rab7對Raw264.7巨噬細胞中R848激活TLR7(Toll like receptor-7)所產(chǎn)生的細胞因子的影響，并探討Rab7對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。方法：使用Rab7刺激silence-Rab7-Raw264.7細胞，檢測R848激活TLR7后產(chǎn)生的TNF-α、IL-6、IFN-α、IFN-β與IP-10，通過Western blot檢測MAPK的磷酸化水平，分析Rab7對MAPK的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。結(jié)果：Rab7對TLR7激活后細胞因子的產(chǎn)生具有抑制作用，Rab7對MAPK信號通路具有抑制作用。結(jié)論：本實驗結(jié)果進一步說明Rab7 是TLR7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負向調(diào)控因子，并且參與到MAPK信號通路中。

Rab7；TLR7；Raw264.7細胞；MAPK

Rab蛋白是小分子三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合蛋白超家族中最大的亞家族之一，Rab蛋白家族成員的特征就是特異地定位在胞質(zhì)中的某些亞細胞器上，并可能成為他們的標志物[1]。作為Ras蛋白超家族中的一類小G蛋白，Rab7蛋白具有介導(dǎo)晚期胞內(nèi)體與溶酶體的膜融合、參與晚期蛋白轉(zhuǎn)運到溶酶體過程的特定生物學(xué)功能。Rab7通過促進溶酶體的運輸還可以清除胞內(nèi)病毒[2]。Rab7除了調(diào)控內(nèi)吞過程的晚期運輸外，還參與了受體的轉(zhuǎn)運，如將表皮生長因子受體轉(zhuǎn)運到溶酶體降解[3,4]。近年來，越來越多的研究表明，Rabs蛋白除了參與調(diào)節(jié)囊泡的轉(zhuǎn)運外，還廣泛地參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。研究表明，Rab11通過調(diào)控JNK和Raf/MAPK-ERK途徑調(diào)控果蠅翅膀的發(fā)育[5]；Rab GTPase 通過調(diào)控VEGFR2的轉(zhuǎn)運和信號通路調(diào)控內(nèi)皮細胞的遷移[6]。之前的研究證明，Rab7能夠參與細胞凋亡，例如在甲狀腺癌中，Rab7的表達量增加[7]。Rab7的過表達能抑制LPS/TLR4及GpG/TLR9信號通路。 同時Rab7很有可能負向調(diào)控TLR7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是關(guān)于Rab7怎樣參與調(diào)節(jié)天然免疫中TLR7信號通路還有待探索。

TLRs廣泛表達于固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)，通過識別內(nèi)外源性致病原含有的保守病原體相關(guān)模式分子(PAMP)，產(chǎn)生趨化因子和細胞因子，啟動天然免疫應(yīng)答[8]。TLR7是在結(jié)構(gòu)上高度保守的蛋白質(zhì)，故可以結(jié)合單鏈RNA(ssRNA)病毒[9]。研究發(fā)現(xiàn)小鼠TLR7 可以識別用于治療病毒感染的合成化合物咪唑喹啉，R848(resiquimod，S-28463)是一種合成的鳥嘌呤核苷酸類似物，是一種小分子免疫調(diào)節(jié)劑，屬于咪唑喹啉類化合物家族，通過TLR7-MyD88 信號途徑和TLR8 發(fā)揮作用。在R848刺激下，TLR7信號通路被活化，產(chǎn)生一系列細胞因子，啟動免疫應(yīng)答。

本實驗采用小鼠單核細胞/巨噬細胞株Raw264.7作為模型，構(gòu)建Rab7-siRNA并轉(zhuǎn)染巨噬細胞，研究Rab7沉默后對R848激活的巨噬細胞Raw264.7中細胞因子的影響。同時，通過免疫印跡技術(shù)檢測分析R848激活的巨噬細胞中MAPK信號通路的變化情況。本實驗為進一步研究Rab7在TLR7信號通路中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細胞系Raw264.7 購自北京協(xié)和細胞庫；胰蛋白酶、R848購自Sigma公司； FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自Roche；Rab7-siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；OPTI-MEM、DMEM購自Gibco;胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；BCA生工公司；RIPA細胞裂解液購自碧云天公司；細胞總RNA 抽提試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、SYBR RTQ-PCR試劑來自 TaKaRa；actin、p-p38/p38、pJNK /JNK、p-ERK/ERK抗體均購自美國Cell Signaling公司；Western blot二抗購自LI-COR公司。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 小鼠巨噬細胞株Raw264.7的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Raw264.7細 胞 株 接 種 于 含10%胎 牛 血 清 的DMEM培養(yǎng)基中;置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 d傳代一次，置 37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將RAW264.7細胞以2×105/孔的細胞數(shù)接種于6孔板上，參照FuGENE HD的說明書進行轉(zhuǎn)染Rab7-siRNA，每孔加入終濃度10 ng/ml的R848。

1.2.2 Real-time PCR 總RNA 的提取采用Trizol提取法，測定濃度后用1 μg RNA進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR和Real-time PCR使用的引物序列如表1，Real-time PCR計算方法采用2-ΔΔCt法。

1.2.3 Western blot 檢測Rab7沉默對JNK、ERK 和p38MAPK 信號通路的影響

1.2.3.1 細胞總蛋白提取 取轉(zhuǎn)染Rab7-siRNA和未轉(zhuǎn)染的Raw246.7細胞，加入R848處理一定時間后，收集細胞，PBS 洗滌兩次，加入RIPA細胞裂解液100 μl，4℃ 14 000 r/min離心10 min，將上清按需分裝，保存于-70℃，蛋白濃度以BCA試劑盒進行蛋白定量。

1.2.3.2 Western blot 各組取等量蛋白提取液，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上;取膜并用Odssey Blocking Buffer封閉后，與兔抗鼠p-JNK/JNK、p-ERK/ERK和p-p38 /p38 MAPK 的單克隆抗體(1∶1 000)于4℃反應(yīng)過夜，洗膜后再與羊抗兔IRDye800CW二抗(1∶15 000)室溫反應(yīng)2 h，洗膜后利用ODYSSEY CLX檢測特異性蛋白條帶，采用Imagine Studio軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行t檢驗分析，P< 0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P< 0.01認為差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 R848刺激Raw264.7細胞后對Rab7mRNA表達水平的影響 我們研究了TLR7 配體R848活化的信號通路對Rab7表達的影響。在R848刺激Raw264.7細胞不同時間后,用RT-PCR和Real-time PCR研究Rab7 mRNA的表達量變化。如圖1A所示，R848刺激后Rab7 mRNA表達量在6 h達到最大。之后逐漸降低。通過Real-time PCR驗證在R848刺激后4 h Rab7的表達量是初始量的3倍之多，6 h達到最高，是初始量的6倍。上述結(jié)果表明，R848正向調(diào)控Rab7的表達。由此我們推斷Rab7可能參與了R848/TLR7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

表1 引物序列

Tab.1 Primers sequence

NameSequenceLength(bp)Rab7-sence5'-CACTTTCAAAACCCTCG-3'324Rab7-antisence5'-TTCTTGGCACTGGTCTCG-3'IL-6-sence5'-CTTGGGACTGATGCTGGTG-3'378IL-6-antisence5'-CTGGCTTTGTGTTTCTTGTT-3'TNF-α-sence5'GAGTGACAAGCCTGTAGCC-3'461TNF-α-antisence5'-AACACCCATTCCCTTCAC-3'IFN-β-sence5'-CGTTCCTGCTGTGCTTCT-3'162IFN-β-antisence5'-GTCCGCCCTGTAGGTGAG-3'IP-10-sence5'-TGCCGTCATTTTCTGCCT-3'148IP-10-antisence5'-GGTCATCATTCTTTTTCATCGT-3'β-actin-sence5'-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3'298β-actin-antisence5'-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3'IFN-α-sence5'-GGAATCCAAAGTCCTTCCTGTCCT-3'173IFN-α-antisence5'-CTGTGCTTTCCTGATGGTCCTG-3'

2.2 Rab7沉默后對R848誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞中TNF-α、IL-6的影響 Rab7對R848刺激后，巨噬細胞內(nèi)IL-6和TNF-α的分泌主要受MyD88依賴途徑調(diào)控。從圖2中可以看出，Rab7沉默后，R848誘導(dǎo)的巨噬細胞中IL-6和TNF-α的分泌增加。結(jié)果說明，Rab7對R848誘導(dǎo)的Raw264.7細胞中IL-6和TNF-α有抑制作用。

2.3 Rab7沉默后對R848誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞中IFN-α、IFN-β的影響 前面的研究結(jié)果顯示，Rab7能夠抑制R848誘導(dǎo)的巨噬細胞中IL-6和TNF-α的分泌，這兩個細胞因子主要是依賴TLR7/MyD88信號通路。而IFN-α、IFN-β是由MyD88非依賴通路激活轉(zhuǎn)錄因子IFR-7調(diào)控的，因此，我們通過Real-time PCR檢測Rab7沉默后IFN-α、IFN-β的變化。如圖3所示，Rab7沉默后IFN-α、IFN-β的表達顯著增加，說明Rab7對IRF-7信號通路也有抑制作用。

2.4 Rab7沉默后對 R848誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞中IP-10的影響 我們還檢測了MyD88非依賴途徑產(chǎn)生的下游細胞因子IP-10的表達量變化。從圖4可以看出，R848刺激Rab7沉默后對IP-10 mRNA表達并沒有顯著的影響。

圖1 R848刺激Raw264.7細胞不同時間Rab7的變化Fig.1 Detection of Rab7 expression in Raw264.7 cellNote: A.The result of RT-PCR detection; B.The result of Real-time PCR；*.P<0.05,**.P<0.01.

2.5 Rab7對 R848誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞中MAPK信號通路的影響 為了考察Rab7沉默后R848誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞中MAPK信號通路，用R848處理培養(yǎng)的Rab7-siRNA轉(zhuǎn)染的RAW246.7細胞，觀察MAPK 信號通路三個主要成員，即ERK1/2、JNK、p38 MAPK 變化。用Western blot的方法檢測R848處理后三個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的磷酸化水平變化。結(jié)果顯示，當R848作用于Rab7-siRNA轉(zhuǎn)染的RAW246.7細胞后，ERK的磷酸化在40 min顯著升高；JNK的磷酸化水平在20～40 min內(nèi)增高，隨后降低；而p38 MAPK 的磷酸化水平變化不是特別明顯，見圖5。表明，Rab7對R848激活的巨噬細胞中MAPK信號通路具有抑制作用，抑制ERK 和JNK信號通路，其中抑制ERK的磷酸化尤為明顯；而對p38 MAPK信號通路的抑制作用不太明顯。

圖2 mRab7抑制R848誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6的表達Fig.2 mRab7 inhibited expression of TNF-α and IL-6Note: The result of Real-time PCR. The figure represent the mean result of three independent experiments, *.P<0.05,**.P<0.01.

圖3 mRab7抑制R848誘導(dǎo)的IFN-α、IFN-β的表達Fig.3 mRab7 inhibited expression of IFN-α and IFN-β Note: The result of Real-time PCR. The figure represent the mean result of three independent experiments, *.P<0.05.

圖4 mRab7抑制R848誘導(dǎo)的IP-10的表達Fig.4 mRab7 inhibited expression of IP-10Note: The result of Real-time PCR. The figure represent the mean result of three independent experiments.

圖5 Rab7對MAPK信號通路的影響Fig.5 Effect of Rab7 on MAPK pathway Note: A.Western blot analysis with R848(10 ng/L) stimulation;B.Quantitative analysis by software (ODYSSEY imagine studio).

3 討論

Rab蛋白參與胞膜的轉(zhuǎn)運與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。之前的研究證明了Rab7可能是TLR7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負向調(diào)控因子，并且這種作用依賴于Rab7與GDP結(jié)合的活性形式。本文結(jié)果表明:Rab7沉默后的小鼠巨噬細胞中，TLR7被相應(yīng)的配體R848激活后，MyD88接頭蛋白活化下游信號通路激活的細胞因子例如TNF-α、IL-6的表達顯著增加，這進一步說明Rab7對TLR7激活后的MyD88依賴途徑具有抑制作用，而這一點可能與細胞因子導(dǎo)致細胞凋亡、引起炎癥的發(fā)生有關(guān)。Rab7負責抑制TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，其作用機理還有待進一步的實驗研究。TLR7與其配體結(jié)合后，TRIF途徑(MyD88非依賴途徑)主要活化產(chǎn)生IFN-α、IFN-β、IP-10和CxC趨化因子等細胞因子。文中結(jié)果表明，Rab7沉默后的小鼠巨噬細胞中，IFN-α、IFN-β的表達量變化明顯，顯示Rab7也作用于TRIF途徑。

ERK相關(guān)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認為是經(jīng)典MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細胞增殖與分化、細胞形態(tài)維持、細胞骨架的構(gòu)建、細胞凋亡和細胞的癌變等多種生物學(xué)反應(yīng)。JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK通路的一重要分支，它在細胞周期、生產(chǎn)、凋亡和細胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用。P38MAPK信號通路具有負向調(diào)節(jié)細胞周期的功能，對腫瘤的抑制作用，具有促進細胞生存的能力。本實驗結(jié)果表明，Rab7對MAPK信號通路具有抑制作用，對ERK的抑制作用尤為顯著，這可能與巨噬細胞受到刺激導(dǎo)致的分化與增殖有關(guān)。本實驗證實了不僅Rab7對TLR7激活的MyD88途徑具有抑制作用，在MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也發(fā)揮著作用，抑制MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的產(chǎn)生，作用機理和意義有待于進一步的實驗揭示。

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[收稿2017-02-14]

(編輯 倪 鵬)

Effects of Rab7 gene silencing on cytokine and MAPK signal pathway activated by R848 in macrophage

ZOUKai,YUNXiao-Le,KANGHong-Bin,WANGXue,ZHANGXiao-Hui,XIEJi-Ming,WANGYu-Zhen.

CollegeofLifeScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018，China

Objective:To investigate the effect of Rab7 on cytokine induced by TLR7 (Toll like receptor-7) R848 activated in Raw264.7,and discusses the influence of Rab7 on MAPK signal transduction.Methods: TLR7 downstream cytokines such as TNF-α,IL-6,IFN-α,IFN-β and IP-10 activated by R848 were detected through Q-PCR in Rab7 silenced mouse macrophages,and then analysis of phosphorylation of MAPK determined with Western blot showed the effect of Rab7 on signal transduction of MAPK.Results: Rab7 inhibit production of cytokine activated by TLR7,and also,Rab7 had an inhibitory effect on MAPK signal pathway.Conclusion: The experimental results further illustrate that the Rab7 is the TLR7 signal transduction pathway negative regulatory factor,and to participate in MAPK signaling pathway.

Rab7;TLR7;Raw264.7 cell;MAPK

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.002

①本文受國家自然科學(xué)基金(31270922，81360394)和內(nèi)蒙古自治區(qū)碩士研究生創(chuàng)新基金(520151012907，520151012908，2015ms08 124)資助。

鄒 凱(1992年-)，男，在讀碩士，主要從事分子免疫與分子病理學(xué)方面研究，E-mail：1787748699@qq.com。

及指導(dǎo)教師：王玉珍(1976年-)，女，博士，教授， 主要從事天然免疫應(yīng)答調(diào)控方面的研究，E-mail：wangyuzhen817@126.com。

R392

A

1000-484X(2017)07-0967-04

②內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，呼和浩特010010。

③內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，呼和浩特010020。