溫麗蘋 ,李 琳 ,程云輝 ,丁 利 ,許 宙?

(1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院,長沙 410114;2.湘潭大學(xué)化工學(xué)院,湘潭 411105)

重金屬污染是一個(gè)全球性問題,鎘是一種常見的重金屬元素,主要應(yīng)用于油漆著色、鎳鎘電池和電鍍等工業(yè)領(lǐng)域,因此廣泛分布于空氣、水、土壤等環(huán)境中[1]。鎘是一種累積毒素,經(jīng)食物鏈和水?dāng)z入,在肺、腎和肝臟等人體器官中積累后,會(huì)對人體的腎臟、肝臟、心血管、神經(jīng)等方面造成損害[2-5]。以尿鎘計(jì),鎘的生物半衰期男性為11～19 a,女性為18～35 a[6]。鎘污染已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類健康,已被列為環(huán)境與食品污染的主要公害之一[7]。世界衛(wèi)生組織和美國環(huán)境保護(hù)署規(guī)定飲用水中Cd2＋的限量標(biāo)準(zhǔn)為3μg·L-1[7-8]。因此,對水樣中低含量Cd2＋的測定要求越來越高。迄今為止,已開發(fā)出許多方法用于測定環(huán)境和生物樣品中Cd2＋的分析,如原子吸收光譜法[9]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICPMS)[10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[11]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[12-13]等。但這些分析方法常需要專業(yè)人員操作,且存在耗時(shí)長、成本高、操作復(fù)雜等問題,因此迫切需要建立一種低成本的快速測定Cd2＋的方法,這對環(huán)境監(jiān)測和保障人身健康至關(guān)重要。

近幾十年來,隨著納米科技的發(fā)展,納米材料由于具有靈敏度高、特異性好、快速經(jīng)濟(jì)的突出優(yōu)勢,用于物質(zhì)快速分析的研究受到了人們的廣泛關(guān)注[14-15]。如基于超順磁性和親和分離原理的磁性納米材料已成功地應(yīng)用于脫氧核糖核酸(DNA)、多糖、蛋白質(zhì)、重金屬及毒素等的測定[16-19]。近年來,由于抗原-抗體的免疫識(shí)別作用可以有效地提高測定方法的特異性,關(guān)于綜合利用磁性納米材料與其他納米材料,并結(jié)合抗原-抗體的特異性免疫識(shí)別作用構(gòu)建競爭性免疫傳感器用于測定毒素、細(xì)菌的研究相繼被報(bào)道[20-21]。

基于此,本工作擬利用磁納米顆粒和金納米顆粒(Au NPs)為載體,表面分別進(jìn)行鎘-抗原和鎘-抗體的功能化,并于功能化Au NPs表面修飾乙酰膽堿酯酶(ACh E),從而構(gòu)建了ACh E 酶聯(lián)增敏生物傳感器。方法基于抗原-抗體的免疫識(shí)別作用驅(qū)動(dòng)磁納米顆粒和Au NPs發(fā)生競爭性自組裝形成組裝體,組裝體催化底物乙酰膽堿(ACh)水解產(chǎn)生乙酸,引起反應(yīng)體系的酸度變化,實(shí)現(xiàn)對Cd2＋的高特異性與高靈敏度的測定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

PHBJ-260型pH 計(jì);JEOL JEM-2100 型透射電子顯微鏡(TEM);Zetasizer nano型激光粒度儀;85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器;HH-WO-2型恒溫油水浴鍋;TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)。

Cd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0μg·L-1。

pH 7.4的0.05 mmol·L-14-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖溶液:將2.38 g(10 mmol)HEPES溶于180 mL水中振搖至全溶,一邊攪拌一邊緩慢滴加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液至pH 為7.4,然后用水定容至200 mL。

所用試劑均為分析純,試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)原理

Fe3O4磁納米顆粒用鎘-抗原進(jìn)行功能化修飾,Au NPs用鎘-抗體和AChE進(jìn)行功能化修飾。當(dāng)體系中不存在Cd2＋時(shí),大量ACh E 修飾的功能化Au NPs與功能化Fe3O4結(jié)合,磁分離后,Fe3O4-抗原-抗體-Au NPs-AChE 組裝體催化底物ACh 水解產(chǎn)生大量乙酸,引起體系反應(yīng)前后較大的pH 變化(反應(yīng)前后的pH 差值以ΔpH 表示);而隨著Cd2＋的增加,Cd2＋會(huì)和功能化Fe3O4產(chǎn)生競爭,被功能化Au NPs 上的鎘-抗體特異性識(shí)別,磁分離后,Fe3O4-抗原-抗體-Au NPs-AChE 組裝體減少,其催化底物ACh水解引起體系的ΔpH 較小?；诖嗽?可根據(jù)反應(yīng)體系ΔpH 與Cd2＋的含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,實(shí)現(xiàn)對Cd2＋的測定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Fe3O4磁納米顆粒的制備及其功能化修飾

采用水熱法[22]合成Fe3O4磁納米顆粒:于燒杯中加入15 mL 乙二醇,分別添加1.2 g 乙酸鈉和0.5 g六水合氯化鐵攪拌至溶解,稱取0.375 g聚乙二醇繼續(xù)加入上述混合液中,攪拌4 h使其充分溶解。將該溶液全部轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)膽中,并置于不銹鋼反應(yīng)釜中,于210 ℃油浴鍋中加熱反應(yīng)12 h。待反應(yīng)釜冷卻后,將得到的黑色產(chǎn)物用無水乙醇和水各洗滌3次,并于無水乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

抗原功能化Fe3O4(Fe3O4-抗原)的制備:將文獻(xiàn)[23-24]報(bào)道的方法做適當(dāng)調(diào)整,取200μL 上述制備的Fe3O4溶液于離心管中,加入25 μL 的0.6 g·L-11-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽溶液和25μL的0.4 g·L-1硫代羥基琥珀酰亞胺溶液混勻作為A 液;將20μL的0.1 g·L-1鎘-抗原溶液加入到980μL 的0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中作為B 液。將以上A、B 兩種溶液混合,室溫下?lián)u床孵育反應(yīng)1.5 h 得到Fe3O4-抗原,以6 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,用適量0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)洗滌一次后將沉淀物復(fù)溶于1 mL 的10 g·L-1牛血清白蛋白溶液中,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Au NPs的制備及其功能化修飾

采用檸檬酸鈉還原法[25]制備Au NPs:取97.5 mL水及2.5 mL的1 mmol·L-1氯金酸溶液加入到錐形瓶中,高速磁力攪拌加熱至沸騰,保持7～8 min后迅速加入2 mL的10 g·L-1檸檬酸三鈉溶液,加熱15 min后,持續(xù)攪拌約15 min,冷卻至室溫,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抗體功能化Au NPs(Au NPs-抗體)的制備:用pH 8.0的0.002 mol·L-1硼酸鹽緩沖溶液將抗體稀釋至6 mg·L-1,取1 mL 作為C 液備用;另取1 mL制得的Au NPs溶液并向其中加入8μL 的0.1 mol·L-1碳酸鉀溶液混勻,作為D 液。將上述C、D 兩種溶液混合,室溫下?lián)u床孵育50 min后加入50μL 100 g·L-1的牛血清白蛋白溶液,在室溫下?lián)u床孵育2 h。將孵育后的混合物以7 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心25 min,并將沉淀物重懸于含有50 g·L-1海藻糖的0.002 mol·L-1硼酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)中,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ACh E修飾Au NPs-抗體(ACh E-Au NPs-抗體)的制備:將50μL Au NPs-抗體溶液與10μL 的1 g·L-1ACh E溶液混合均勻,黑暗環(huán)境中于室溫?fù)u床孵育2 h,以6 500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心15 min,棄去上清液,沉淀物重懸于50μL水中備用。

1.3.3 螯合劑的制備

游離的Cd2＋不能被鎘-抗體直接識(shí)別,需先將Cd2＋與乙二胺四乙酸反應(yīng)生成螯合物,才能與抗體結(jié)合。

將0.05 mol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)和50 mmol·L-1的乙二胺四乙酸溶液以體積比10∶1混合均勻作為螯合劑。取50μL 的待測水樣加入到離心管中,并向離心管中加入50μL 上述螯合劑,于室溫下?lián)u床孵育2 h。

1.3.4 ΔpH 的測定

分別移取50 μL Cd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液和30 μL Fe3O4-抗原溶液混合均勻,加入100μL 的ACh EAu NPs-抗體溶液,室溫下?lián)u床孵育反應(yīng)1 h,磁分離后除去上清液,重懸于200μL 的25 mmol·L-1ACh溶液中,水解1 h,用pH 計(jì)測定水解前后體系的Δp H。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

納米材料的尺寸、粒徑、分散性會(huì)直接影響納米材料在功能化修飾和特異性結(jié)合時(shí)的效果[26]。Au NPs、Fe3O4、Au NPs-Fe3O4復(fù)合物的TEM 圖見圖1。

由圖1可知:制備的Au NPs、Fe3O4分散性較好,顆粒大小相對均勻,其平均粒徑分別為13,125 nm;當(dāng)體系中沒有Cd2＋存在時(shí),功能化Au NPs和功能化Fe3O4通過抗原-抗體間的特異性識(shí)別順利組裝,得到Au NPs-Fe3O4復(fù)合物,其平均粒徑為140 nm。

圖1 Au NPs、Fe3O4、Au NPs-Fe3O4復(fù)合物的TEM 圖Fig.1 TEM images of Au NPs,Fe3O4and Au NPs-Fe3O4complex

動(dòng)態(tài)光散射測得的材料的平均粒徑(水合粒徑)一般比材料的實(shí)際粒徑略大,這是因?yàn)閯?dòng)態(tài)光散射測得的是材料的流體動(dòng)力學(xué)直徑[27],但該表征方法仍可用來分析納米顆粒的尺寸變化。

Au NPs、Fe3O4、Au NPs-抗體、Fe3O4-抗原和Au NPs-Fe3O4復(fù)合物的水合粒徑見圖2。

圖2 Au NPs、Fe3O4、Au NPs-抗體、Fe3O4-抗原和Au NPs-Fe3O4復(fù)合物的水合粒徑Fig.2 Hydrated particle sizes of Au NPs,Fe3O4,Au NPs-antibody,Fe3O4-antigen and Au NPs-Fe3O4complex

由圖2可知:所合成的Au NPs和Fe3O4的水合粒徑均呈正態(tài)分布,平均水合粒徑分別為22,510 nm;Au NPs-抗體和Fe3O4-抗原的平均水合粒徑分別增加至46,613 nm;當(dāng)沒有Cd2＋存在時(shí),Au NPs-抗體和Fe3O4-抗原通過抗原-抗體間的特異性識(shí)別作用形成Au NPs-Fe3O4復(fù)合物,平均水合粒徑增加到740 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

用水將1.0μg·L-1Cd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋成0.001,0.020,0.050,0.100,0.200,0.500,1.00,2.00,5.00,10.0μg·L-1的Cd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按試驗(yàn)方法測定Cd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的Δp H,將ΔpH 與Cd2＋的質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行擬合,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:反應(yīng)體系的ΔpH 與Cd2＋質(zhì)量濃度的對數(shù)值lnρ成負(fù)相關(guān),Cd2＋的線性范圍為0.001～10.0μg·L-1,線性回歸方程為y＝-0.177 8 lnρ＋0.504 0,相關(guān)系數(shù)為-0.997 0。

以平行測定10次的空白樣品的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k)計(jì)算方法的檢出限(3s/k),結(jié)果為0.24 ng·L-1。

幾種基于納米材料測定Cd2＋的方法參數(shù)對比見表1。

由表1可知:將酶聯(lián)增敏法(本方法)與基于納米材料測定Cd2＋的其他方法進(jìn)行比較,本方法的檢出限較低,具有一定的優(yōu)勢。

2.3 特異性試驗(yàn)

為評價(jià)制得的酶聯(lián)增敏生物傳感器(Cd2＋傳感器)的特異性,選用Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Pb2＋、Co2＋作為可能存在的共存重金屬離子進(jìn)行特異性試驗(yàn)。分別配制10μg·L-1的Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Pb2＋、Co2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法測定其Δp H。結(jié)果表明:Cd2＋、Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Pb2＋、Co2＋的ΔpH 依次為0.92,0.03,0.02,0.01,0.03,0.01?？梢钥闯?該酶聯(lián)增敏生物傳感器對10μg·L-1的其他重金屬元素響應(yīng)較弱,故Cd2＋測定方法特異性良好。

表1 幾種基于納米材料測定Cd2＋的方法參數(shù)對比Tab.1 Comparison of parameters obtained by several determination methods for Cd2＋based on nanomaterials

2.4 回收試驗(yàn)

移取適量空白的自來水樣品、湖水樣品和池塘水樣品,用0.22μm 濾膜將水樣過濾,在14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心15 min,去除水樣中可能存在的懸浮顆粒物。按試驗(yàn)方法對上述過濾、離心后的空白水樣進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),同時(shí),采用ICP-MS[33]進(jìn)行測定,樣品分析結(jié)果見表2。

表2 樣品分析結(jié)果(n＝10)Tab.2 Analytical results of the samples(n＝10)

由表2可知:本法的回收率為91.2%～107%,RSD 為3.5%～5.4%;本法的測定結(jié)果與ICP-MS的測定結(jié)果基本一致,本法可用于實(shí)際水樣中Cd2＋的測定。

本工作以Fe3O4磁納米顆粒和Au NPs為載體,利用抗原-抗體的特異性識(shí)別作用構(gòu)建了AChE聯(lián)增敏生物傳感器測定Cd2＋。方法具有簡便快速、特異性好、靈敏度高、成本低的特點(diǎn),可用于Cd2＋的快速測定。