(延邊朝鮮族自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所,延吉 133000)

黑參是五加科植物人參經(jīng)九蒸九曝、反復(fù)蒸干而制成的一種新型人參炮制品。近年來,隨著物質(zhì)生活水平的提高,人們?cè)絹碓街匾暯】?人參作為吉林省的地理標(biāo)志產(chǎn)品,在國內(nèi)外保健品市場(chǎng)受到廣泛關(guān)注,許多保健功能食品都以人參為基本原料。根據(jù)國內(nèi)外研究,黑參含有人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg5和人參皂苷Rk1等20多種稀有皂苷,還富含多糖、氨基酸、有機(jī)酸和酯類、甾醇及其糖苷、含氮化合物、維生素、黃酮類和一些微量元素[1-2]。與傳統(tǒng)紅參、白參相比,黑參具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗血栓和降血糖等藥理作用,能增強(qiáng)免疫力[3]。由于生產(chǎn)加工過程中需要高溫,黑參在長(zhǎng)期高溫加工過程中可能導(dǎo)致苯并芘的產(chǎn)生。

苯并芘又稱苯并[α]芘(BaP),屬多環(huán)芳烴,是一種高活性的間接致癌物質(zhì)和突變?cè)?。苯并芘可通過吸入、食用、經(jīng)皮吸收等途徑侵入人體,刺激人的眼睛和皮膚,長(zhǎng)期接觸可能會(huì)導(dǎo)致DNA 受損和細(xì)胞癌變[4]。目前,在苯并芘的含量測(cè)定中,大多采用氣相色譜-質(zhì)譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜法[6]、液相色譜-熒光檢測(cè)法等[7-10]。本工作基于現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并芘的測(cè)定》,進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件,采用超聲波萃取-反相高效液相色譜-熒光法測(cè)定黑參中苯并芘的含量,該方法簡(jiǎn)單、高效、快速,以期為今后黑參加工生產(chǎn)中產(chǎn)生的苯并芘的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配熒光檢測(cè)器;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;苯并芘分子印跡固相萃取柱(1 000 mg/6 mL)。

苯并芘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L-1,稱取苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,置于50 mL棕色容量瓶中,加入適量乙腈超聲溶解后,用乙腈定容,配制成100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于0～4 ℃避光保存。

苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 mg·L-1,移取苯并芘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.0 mL,置于100 mL棕色容量瓶中,用乙腈定容,配制成1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

苯并芘對(duì)照品,純度大于99%;黑參為實(shí)驗(yàn)室送檢樣品;正己烷、二氯甲烷為分析純;乙腈為色譜純;試驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.2 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫35 ℃;流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相為88%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液;激發(fā)波長(zhǎng)365 nm,發(fā)射波長(zhǎng)410 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取粉碎混合后的黑參樣品0.500 0 g,置于50 mL離心管中,加入5 mL 正己烷,漩渦混合0.5 min,于40℃超聲提取0.5 h,以3 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min,收集上清液,用同樣的方法再次提取殘?jiān)?合并提取液。依次用二氯甲烷5 mL、正己烷5 mL活化苯并芘分子印跡固相萃取柱,將上述待純化液移至固相萃取柱中,當(dāng)液位降至柱床時(shí),用正己烷8 mL淋洗,棄去淋洗液,然后用二氯甲烷8 mL洗脫,洗脫液收集在雞心瓶中,于38℃減壓蒸除溶劑。加入乙腈1 mL,漩渦溶解0.5 min,經(jīng)0.22μm 有機(jī)濾膜過濾,即得樣品溶液,按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。另取一只離心管,加入正己烷0.500 0 g,按上述方法處理,制得空白溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

試驗(yàn)主要從樣品溶劑、流動(dòng)相組成、儀器參數(shù)設(shè)置、進(jìn)樣量等方面選擇色譜條件。根據(jù)苯并芘的物理性質(zhì),可溶于有機(jī)溶劑如苯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、丙酮等,其中正己烷是烷烴,與脂肪酸、脂肪烴和芳香烴均有很好的互溶性,故試驗(yàn)中以正己烷為溶劑從樣品中提取苯并芘,并以正己烷作為淋洗劑,淋洗固相萃取柱,可有效地溶解、除去脂肪酸類雜質(zhì)等,同時(shí)鑒于苯、甲苯、三氯甲烷的強(qiáng)烈毒性,選擇二氯甲烷作為洗脫劑。

試驗(yàn)考察了90%(體積分?jǐn)?shù))乙腈溶液、88%乙腈溶液、85%(體積分?jǐn)?shù))乙腈溶液、80%(體積分?jǐn)?shù))作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)樣品的分離效果。結(jié)果表明,88%乙腈溶液作為流動(dòng)相時(shí),苯并芘和雜質(zhì)峰能較好地分離,且保留時(shí)間最短。

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),熒光法測(cè)定苯并芘響應(yīng)信號(hào)較高,為保證峰形的清晰度和對(duì)稱性,試驗(yàn)選擇進(jìn)樣量為10μL;用熒光光譜儀掃描苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液,發(fā)現(xiàn)激發(fā)波長(zhǎng)在365 nm 處有最大吸收峰,發(fā)射波長(zhǎng)在410 nm 處有最大吸收峰。色譜柱選用的Agilent TC-C18色譜柱為反相柱,所得苯并芘色譜圖基線噪聲小、漂移小、峰形對(duì)稱,定性和定量重現(xiàn)性良好,空白溶液吸收值為零,對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無干擾,系統(tǒng)適應(yīng)性好,專屬性強(qiáng)。按上述條件測(cè)得的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液的色譜圖見圖1。

2.2 凈化柱的選擇

根據(jù)現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27-2016中苯并芘的檢測(cè)方法,苯并芘凈化柱包括中性氧化鋁固相萃取柱和分子印跡固相萃取柱。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用中性氧化鋁固相萃取柱時(shí),溶劑消耗量大,試驗(yàn)成本增加,而使用分子印跡固相萃取柱試劑消耗少、凈化效果好,在批量樣品測(cè)定時(shí),操作更加方便、簡(jiǎn)單,具有一定的優(yōu)勢(shì)。因此,試驗(yàn)選擇分子印跡固相萃取柱。

圖1 苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液和黑參樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of benzopyrene standard solution and black ginseng sample solution

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別移取適量的苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈逐級(jí)稀釋,配制成0.50,1.0,5.0,10.0,20.0μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,以苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明:苯并芘的質(zhì)量濃度在0.50～20.0μg·L-1內(nèi)呈線性關(guān)系,所得線性回歸方程為y＝45.09x-1.140,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。按儀器的3倍的信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限(3S/N),結(jié)果為0.20μg·kg-1。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

對(duì)空白基質(zhì)進(jìn)行不同濃度水平下(2.00,10.00,20.00μg·kg-1)的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)樣品按試驗(yàn)方法平行測(cè)定6次,外標(biāo)法定量,所得的回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表1。

由表1可知:加標(biāo)回收率為92.8%～97.5%,表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

取10.0μg·L-1苯并芘標(biāo)準(zhǔn)溶液,重復(fù)測(cè)定6次,記錄苯并芘色譜峰峰面積,分別為451.0,449.0,452.8,453.4,451.0,450.6,計(jì)算得峰面積的RSD 為0.06%,表明儀器精密度良好,準(zhǔn)確度高。

取同一樣品溶液,重復(fù)測(cè)定6次,記錄樣品峰面積,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算苯并芘的含量,其測(cè)定值的RSD 為1.1%,說明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 樣品分析

按試驗(yàn)方法測(cè)定編號(hào)為HS1～6的6批次黑參樣品,結(jié)果顯示,6批次黑參樣品中有1個(gè)批次樣品檢出苯并芘,為1.21μg·kg-1,色譜圖見圖1(b),其他5批次黑參樣品中苯并芘含量均低于檢出限。

黑參在加工過程中由于高溫條件可能會(huì)產(chǎn)生一定量的致癌物質(zhì)苯并芘,本工作采用超聲萃取-反相高效液相色譜-熒光法測(cè)定黑參中苯并芘的含量。以正己烷為萃取劑,分子印跡固相萃取柱為凈化柱,所得方法的回收率為92.8%～97.5%。該方法具有前處理簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、專屬性強(qiáng)、靈敏度和檢測(cè)效率高、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn),適用于黑參中苯并芘的測(cè)定。