褚瑩倩 ,陳 溪 ,崔 晗 ,吳 慈 ,林天野 ,賈鈞越

(1.大連海關(guān)技術(shù)中心,大連 116000;2.喬治城大學(xué) 隆巴迪綜合癌癥中心,華盛頓20057)

糖皮質(zhì)激素是一類甾體激素,具有抗過(guò)敏和免疫抑制作用[1],被廣泛運(yùn)用于臨床醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)防治,糖皮質(zhì)激素的大量使用使之易隨生活污水、醫(yī)療廢水、養(yǎng)殖廢水等多種途徑進(jìn)入環(huán)境[2-6]。環(huán)境中的糖皮質(zhì)激素通常處于ng·L－1的濃度水平,表現(xiàn)出內(nèi)分泌干擾特性,易對(duì)水生生態(tài)環(huán)境構(gòu)成潛在威脅,甚至可能危害到人們的飲水安全[7-10]。然而,目前對(duì)環(huán)境水體中糖皮質(zhì)激素的分布特點(diǎn)和濃度水平等方面的研究還非常有限,其中一個(gè)重要原因就是缺乏準(zhǔn)確、快速、高效識(shí)別和測(cè)定環(huán)境水體中該類物質(zhì)的分析方法[11]。

固相萃取技術(shù)在水質(zhì)檢測(cè)的樣品前處理環(huán)節(jié)發(fā)揮了重要作用,主要包括柱固相萃取、分散固相萃取、纖維固相萃取等多種方式。固相萃取技術(shù)通常具有富集效率高、抗干擾能力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),其核心在于固相萃取填料的性能[12],因此新型高性能、高選擇性的填料的制備和應(yīng)用一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

隨著材料技術(shù)的快速發(fā)展,各種新型微米、納米級(jí)材料被廣泛應(yīng)用于固相萃取技術(shù),如碳納米材料、氣凝膠材料、分子印跡材料、有機(jī)骨架材料等。其中,多孔有機(jī)骨架材料(POFs)就是一類由輕元素(C、H、O、N、B)通過(guò)共價(jià)鍵連接剛性構(gòu)建單元形成的有序的多孔材料,具有結(jié)構(gòu)新穎、孔道結(jié)構(gòu)和表面官能團(tuán)可控、比表面積高的特點(diǎn),且表現(xiàn)出良好的機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,廣泛應(yīng)用于氣體存儲(chǔ)、光電器件、藥物釋放、化學(xué)分析等領(lǐng)域[13-20]。

本工作利用自主合成的新型POFs 制備了POFs固相萃取柱,旨在發(fā)展一種新的地表水中21種糖皮質(zhì)激素的固相萃取前處理方法,再采用高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(HPLC-Q/Orbitrap MS)技術(shù)對(duì)地表水中21 種糖皮質(zhì)激素進(jìn)行高通量篩查檢測(cè),以期建立地表水中糖皮質(zhì)激素的有效可行、環(huán)境友好的前處理手段,進(jìn)而為水質(zhì)檢測(cè)提供新的技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Dionex Ulti Mate 3000 型高效液相色譜儀;Thermo Q Exactive Plus型四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀和Xcalibur工作站;N-EVAP 112型氮吹儀;613-UF-70 型純水機(jī);MS3 型數(shù)顯渦旋混合儀;3K15型臺(tái)式冷凍離心機(jī);X205DU 型電子天平(精確至0.01 mg);KH-500DE 型超聲波提取儀;57265型固相萃取裝置;3 mL 固相萃取柱,柱管帶篩板;0.22μm 有機(jī)濾膜;100 mL 大體積儲(chǔ)液管,連接轉(zhuǎn)換頭。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1,稱取適量的糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品(潑尼松、可的松、潑尼松龍、氫化可的松、曲安西龍雙乙酸酯、氟米松、乙酸氟氫可的松、乙酸潑尼松、倍氯米松、甲基潑尼松龍、乙酸可的松、潑尼松龍乙酸酯、乙酸氫化可的松、氟米龍、氟氫縮松、地夫可特、曲安奈德、甲基潑尼松龍乙酸酯、氟米龍乙酸酯、丁酸氫化可的松、布地奈德),用甲醇稀釋,配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L－1單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.00 mg·L－1,移取適量的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于－18 ℃冷凍保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用0.5%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為20,25,50,80,100μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于98.3%,其他信息見表1;乙腈、甲醇、甲酸為色譜純;氨水、丙酮、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、1,3,5-三苯基苯、甲苯、二甲氧基甲烷、三氯化鐵和1,2-二氯乙烷均為分析純;試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Accucore RP-MS色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.6μm);流量0.3 mL·min－1;進(jìn)樣量10μL;柱溫40 ℃;流動(dòng)相A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液,B為甲醇;梯度洗脫程序:0～2.0 min 時(shí),A 為95%;2.0～7.0 min 時(shí),A 由95% 降至70%;7.0～11.0 min時(shí),A 由70%降至10%,保 持2.0 min;13.0～13.1 min 時(shí),A 由10%跳轉(zhuǎn)至95%,保 持2.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

加熱電噴霧離子源,正離子模式,離子源溫度350 ℃;離子傳輸管溫度320 ℃;鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?純度為99.99%),流量分別為12 L·min－1和3 L·min－1;噴霧電壓3.2 k V;透鏡電壓50 V;一級(jí)全掃描/二級(jí)質(zhì)譜(Full MS/dd-MS2)掃描模式。Full MS模式參數(shù):分辨率7×104,自動(dòng)增益控制1×106,最大駐留時(shí)間100 ms,掃描范圍 質(zhì)荷比(m/z)100～1 000,強(qiáng)度閾值1.6×105。dd-MS2模式參數(shù):分辨率17 500,自動(dòng)增益控制2×105,最大駐留時(shí)間50 ms。歸一化碰撞能量30,45,60 e V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 21種糖皮質(zhì)激素的信息和質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Information and MS parameters of 21 glucocorticoids

表1 (續(xù))

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 POFs的制備

于25 mL圓底燒瓶中,分別加入1.20 g 1,3,5-三苯基苯、0.92 g甲苯和3.04 g二甲氧基甲烷,以6.5 g三氯化鐵為聚合反應(yīng)的催化劑,以20 mL 1,2-二氯乙烷為溶劑,整個(gè)體系在80 ℃加熱24 h,使1,3,5-三苯基苯、甲苯和二甲氧基甲烷均勻聚合。待反應(yīng)完成之后,以甲醇為溶劑索氏提取粗產(chǎn)物24 h,去除未充分反應(yīng)的單體和催化劑,將洗滌后的沉淀于80 ℃烘干24 h,用研缽研磨,過(guò)0.15 mm篩,收集得到含有苯基官能團(tuán)的新型POFs,如圖1所示。

圖1 新型POFs的合成Fig.1 Synthesis of novel POFs

1.3.2 POFs固相萃取柱的填裝

選用3 mL固相萃取空柱管,將空柱管分別用丙酮、超純水徹底清洗干凈,去除油污。將下篩板放入柱管底部固定,加入新型POFs 20 mg作為填料,放入上篩板,壓實(shí)填料,形成POFs固相萃取柱,分別用甲醇和乙腈各30 mL 淋洗POFs固相萃取柱,去除填裝過(guò)程引入的雜質(zhì),最后用15 mL 水淋洗POFs固相萃取柱,晾干以備用,如圖2所示。

圖2 POFs固相萃取柱填裝示意圖Fig.2 Schematic of the solid phase extraction column filled with POFs

1.3.3 樣品前處理

水樣經(jīng)過(guò)濾預(yù)處理后,取50 mL 水樣,加入25 mg乙二胺四乙酸二鈉,測(cè)定水樣的酸度,根據(jù)需要用鹽酸或氨水調(diào)節(jié)水樣酸度至中性。用甲醇和水各6 mL對(duì)新型POFs固相萃取柱進(jìn)行活化,連接大體積儲(chǔ)液管,取待凈化水樣過(guò)柱,控制流量為1～2滴/s,待水樣過(guò)柱后,先用5 mL 水淋洗POFs固相萃取柱并吹干,再用6 mL體積比為1∶1的甲醇-乙腈混合溶液洗脫P(yáng)OFs固相萃取柱并收集洗脫液,于40 ℃氮吹至近干。殘?jiān)? mL 0.5%甲醇溶液重新溶解,充分混勻后過(guò)0.22μm 有機(jī)濾膜,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

參考文獻(xiàn)[20]方法,優(yōu)化了色譜條件,在色譜條件下,通過(guò)高分辨質(zhì)譜的Full MS/dd-MS2模式,設(shè)定掃描范圍m/z100～1 000,利用Full MS模式確定目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù)(分子離子峰的m/z)和保留時(shí)間。當(dāng)母離子強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定的強(qiáng)度閾值(1.6×105)時(shí),自動(dòng)進(jìn)行dd-MS2模式掃描,得到對(duì)應(yīng)母離子精確質(zhì)量數(shù)的二級(jí)離子全掃描質(zhì)譜信息,選擇至少2個(gè)具有代表性的二級(jí)碎片離子作為定性離子。將目標(biāo)化合物的名稱、分子式、CAS號(hào)、保留時(shí)間、掃描模式、精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)特征碎片離子等相關(guān)信息輸入TraceFinder軟件,建立高分辨質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置篩查條件為:理論精確質(zhì)量數(shù)與實(shí)際測(cè)量質(zhì)量數(shù)的誤差絕對(duì)值控制在5×10－6內(nèi),響應(yīng)強(qiáng)度閾值為1×104,匹配最少碎片個(gè)數(shù)為1,相關(guān)信息如表1所示。

2.2 POFs固相萃取柱填料量的選擇

按照試驗(yàn)方法,制作填料量分別為10,15,20,25 mg的新型POFs固相萃取柱,按照固相萃取步驟對(duì)21種糖皮質(zhì)激素加標(biāo)量為1.0μg·L－1的水樣進(jìn)行回收試驗(yàn),結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知:填料量為10 mg的POFs固相萃取柱對(duì)不同化合物的吸附性能差別較大,回收率為41.2%～89.3%;相比而言,填料量為15,20,25 mg的POFs固相萃取柱對(duì)不同化合物的吸附性能差別不大,且回收率均較高。試驗(yàn)最終選取填料量為20 mg的POFs固相萃取柱用于后續(xù)的試驗(yàn)。

圖3 21種糖皮質(zhì)激素在不同填料量的POFs固相萃取柱上的回收率Fig.3 Recovery of 21 glucocorticoids on the solid phase extraction columns filled with different amounts of POFs

2.3 POFs固相萃取柱的重復(fù)性測(cè)試

POFs具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,使得POFs固相萃取柱具有可再生性,進(jìn)而可重復(fù)使用。以加標(biāo)量1.0μg·L－1的6種糖皮質(zhì)激素(可的松、氟氫縮松、氟米松、曲安奈德、倍氯米松和丁酸氫化可的松)的水樣為研究對(duì)象,使用20 mg POFs固相萃取柱對(duì)水樣進(jìn)行回收試驗(yàn)。使用后的POFs固相萃取柱分別用30 mL 甲醇和30 mL乙腈淋洗,以去除殘留在POFs中的干擾物,使POFs 恢復(fù)原有的功能,再用15 mL 水淋洗POFs固相萃取柱,吹干備用。使用同一根POFs固相萃取柱重復(fù)5 次上述回收試驗(yàn),結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知,重復(fù)使用的POFs固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物仍然具有較好的吸附性能,回收率均能夠達(dá)到50%～120%的要求,表明POFs固相萃取柱對(duì)糖皮質(zhì)激素的吸附性能穩(wěn)定,并且至少可以重復(fù)使用5次。

圖4 POFs固相萃取柱的重復(fù)使用次數(shù)-目標(biāo)物回收率的關(guān)系Fig.4 Relationship between reuse times of POFs solid phase extraction column and recovery of target

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定下限

按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以待測(cè)物的分子離子峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,通過(guò)儀器自帶的TraceFinder軟件獲得各目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為20～100μg·L－1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 線性參數(shù)Tab.2 Linearity parameters

表2 (續(xù))

在高分辨質(zhì)譜的分析中,提取的分子離子峰響應(yīng)信號(hào)很強(qiáng),噪聲相對(duì)較低,采用傳統(tǒng)的信噪比(S/N)方法不適用于測(cè)定下限的計(jì)算[21]。因此,對(duì)空白水樣進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),以滿足回收率在50%～120%內(nèi)的最低濃度水平為方法的測(cè)定下限,得到21種糖皮質(zhì)激素的測(cè)定下限為20μg·L－1。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)空白水樣進(jìn)行0.4,1.0,2.0μg·L－1等3個(gè)濃度水平(富集后的加標(biāo)濃度水平分別為20,50,100μg·L－1)的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平制備6個(gè)平行水樣,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.6 樣品分析和方法對(duì)比

以大連地區(qū)6個(gè)水庫(kù)水樣(水庫(kù)1～6)為研究對(duì)象,分別采集1 L水樣,在冷藏條件下于棕色磨口玻璃瓶保存,使用20 mg POFs固相萃取柱,按照試驗(yàn)方法富集并測(cè)定水樣中21種糖皮質(zhì)激素的含量,結(jié)果見表4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of the samples μg·L-1

結(jié)果表明:6個(gè)水庫(kù)水樣中均有不同種類糖皮質(zhì)激素檢出,檢出總量為2.68～11.64μg·L－1(富集后的含量在線性范圍內(nèi)),其中乙酸潑尼松、乙酸可的松、曲安西龍雙乙酸酯在6個(gè)水庫(kù)中均有檢出,為檢出頻率最高的糖皮質(zhì)激素。前期研究中本課題組采用Cleanert PEP-2固相萃取柱(60 mg/3 mL)對(duì)相同水庫(kù)水樣進(jìn)行樣品前處理,經(jīng)過(guò)篩查檢測(cè)得到水樣中激素類化合物的檢出總量為1.79～9.33μg·L－1[22],不同前處理方法對(duì)相同水庫(kù)水樣分析所得結(jié)果在同一個(gè)數(shù)量級(jí)水平,表明本試驗(yàn)建立的分析方法有效且可行。比較兩種不同固相萃取柱對(duì)激素類化合物的富集效率,發(fā)現(xiàn)二者對(duì)水樣中糖皮質(zhì)激素表現(xiàn)出相似的富集濃縮效果,表明自制的新型POFs固相萃取柱對(duì)水樣中糖皮質(zhì)激素的富集是可行且有效的,滿足地表水中糖皮質(zhì)激素的測(cè)定要求。

本工作利用自主合成的新型POFs 制備了POFs固相萃取柱,并優(yōu)化了其填料量,采用HPLCQ/Orbitrap MS技術(shù)對(duì)地表水中21種糖皮質(zhì)激素進(jìn)行高通量篩查檢測(cè),與Cleanert PEP-2固相萃取柱對(duì)水樣中的糖皮質(zhì)激素的富集具有相似效果,表明該方法可行、準(zhǔn)確且高效,滿足地表水中糖皮質(zhì)激素的分析要求。通過(guò)對(duì)新型POFs固相萃取柱的吸附性能的重復(fù)性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該固相萃取柱可以多次重復(fù)使用,可減少很多一次性試驗(yàn)用品的消耗,避免環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。