薛 康 ,鄧惠丹 ,劉睿佳 ,肖 宇 ,馬 麗 ,張 格 ,陳藝峰,何嘉玲,何開蓉*,胡江濤

(1.成都海關(guān)技術(shù)中心,成都 610041;2.食品安全檢測四川省重點實驗室,成都 610041)

芬太尼類物質(zhì)是一種合成的強效阿片類藥物,主要用于麻醉,現(xiàn)已成為全球主要的臨床麻醉藥品,市場銷售量在國內(nèi)麻醉藥品中居第2位,其鎮(zhèn)痛效果是嗎啡的100倍[1-2]。由于少量的芬太尼類物質(zhì)和其他阿片類毒品混合就能達到亢奮的效果,大大降低了制毒成本,國家將芬太尼類物質(zhì)指定為一類受控的新精神活性物質(zhì)。

血液、尿液是芬太尼類物質(zhì)定量分析的較常用的生物檢材。目前針對生物檢材中芬太尼類物質(zhì)的分析可采用免疫分析法進行初步篩查和定性分析,也可采用分光光度法[3]、免疫分析法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5-6]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS)[7-10]進行定性定量分析。但這些方法中多數(shù)基于液液萃取前處理技術(shù),基質(zhì)效應(yīng)明顯,測定結(jié)果易受到干擾,而且僅能分離檢測幾種芬太尼類物質(zhì)。而本工作采用固相萃取前處理技術(shù),結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)對尿液和血液中15種芬太尼類物質(zhì)的含量進行測定,旨在建立一種靈敏度高、操作性強的芬太尼類物質(zhì)的檢測方法,并應(yīng)用于實際樣品中。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class TQ-XS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;3H20RI型離心機;AE 240型電子天平;XW-80A 型渦旋混合器;B8510E-DTH型超聲波清洗器;Mili-Q Integral 3 型超純水儀;Waters Oasis MCX 固相萃取柱(3 mL/60 mg);0.22μm 有機濾膜;15 mL具塞塑料離心管。

混合標準溶液:1.0 mg·L－1,移取15 種芬太尼類物質(zhì)的標準溶液適量,用甲醇稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1的混合標準溶液。使用時用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

內(nèi)標儲備溶液:1.0 mg·L－1,移取適量的芬太尼-d5標準溶液,用甲醇稀釋,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1的內(nèi)標儲備溶液。

內(nèi)標溶液:100μg·L－1,移取適量的內(nèi)標儲備溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度為100μg·L－1的內(nèi)標溶液。

對氟芬太尼、芬太尼、阿芬太尼鹽酸鹽、4-苯胺基-N-苯乙基哌啶、羥化去甲芬太尼、瑞芬太尼鹽酸鹽、卡芬太尼、丁酰芬太尼、呋喃芬太尼、去甲舒芬太尼、2,3-司可芬太尼,3-甲基硫代芬太尼、鹽酸丙烯酰芬太尼、奧芬太尼等標準溶液的質(zhì)量濃度均為100 mg·L－1;乙酰芬太尼標準溶液的質(zhì)量濃度為50 mg·L－1;芬太尼-d5標準溶液的質(zhì)量濃度為100 mg·L－1;甲醇、乙腈、乙酸銨和甲酸均為色譜純;其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.7μm),柱溫35 ℃;流動相A 為含0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨緩沖溶液,B 為乙腈;流量0.25 mL·min－1;進樣量1.0μL。梯度洗脫程序:0～4.0 min時,A 由90%降至75%,保 持1.0 min;5.0～10.0 min 時,A 由75%降至70%;10.0～13.0 min時,A 由70%降至55%;13.0～13.5 min 時,A 由55%跳轉(zhuǎn)至5%;13.5～14.5 min 時,A 由5% 升至90%,保持1.5 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)模式;脫溶劑氣溫度550℃,脫溶劑氣流量1 000 L·h－1;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;霧化氣壓力650 k Pa;毛細管電壓2.83 k V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

表1 (續(xù))

1.3 試驗方法

取尿液或血液樣品1.0 mL 于15 mL 離心管中,加 入100 μg·L－1內(nèi)標溶 液100 μL 和0.1 mol·L－1鹽酸溶液4 mL,振蕩10 min,以轉(zhuǎn)速8 000 r·min－1離心30 min,取上清液,待凈化。分別用甲醇和水各2 mL 活化固相萃取柱,將提取的上清液過柱,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液2 mL 和甲醇2 mL淋洗固相萃取柱,最后用體積比5∶95的氨水-甲醇混合液3 mL 洗脫。收集洗脫液,氮吹至近干,殘渣用 體積比9∶1 的 含0.1% 甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨緩沖溶液-乙腈混合液(初始流動相)溶解并定容至1 mL,經(jīng)0.22μm 有機濾膜過濾,濾液按照儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

試驗考察了含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨緩沖溶液-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈、含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨緩沖溶液-甲醇和0.1%甲酸溶液-甲醇等4組流動相體系的分離效果。結(jié)果表明:當(dāng)以甲醇為有機相時,部分目標物色譜峰的分離度較差;當(dāng)以乙腈為有機相,以0.1%甲酸溶液為水相時,檢測出的目標物的響應(yīng)強度相對較低;而以含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨緩沖溶液-乙腈為流動相時,15 種芬太尼類物質(zhì)不僅分離效果較好,并且離子峰響應(yīng)值也較高,峰形好。因此,試驗選擇以含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨緩沖溶液-乙腈為流動相。在優(yōu)化的儀器工作條件下,混合標準溶液所得的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

芬太尼類物質(zhì)分子主要由苯烷基、哌啶基環(huán)和丙烷基酰胺等組成,其結(jié)構(gòu)容易接受離子而被離子化,因此試驗采用ESI＋模式和MRM 模式優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。為了獲得芬太尼類物質(zhì)的最佳離子化效果,試驗考察了以不同體積比的甲醇、乙腈、水和乙酸銨組成的溶劑的離子化效果,最終確定了以體積比9∶1的含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨緩沖溶液-乙腈混合液(即初始流動相)作為質(zhì)譜進樣溶劑。以100μg·L－1混合標準溶液直接進樣分析,分別對15種芬太尼類物質(zhì)進行一級質(zhì)譜掃描和二級質(zhì)譜掃描,為了得到相對豐度最高的準分子離子峰和子離子峰,對碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化,從而使離子信號達到較強的響應(yīng)。優(yōu)化的質(zhì)譜條件見1.2.2節(jié)。

2.3 前處理方式的選擇

芬太尼類物質(zhì)常見的提取方式為液液萃取法,用乙酸乙酯、叔丁基甲醚或者正己烷提取胃容物、嘔吐物等復(fù)雜基質(zhì)的效果較差。試驗采用凈化效果更好的固相萃取法。在常用的幾種固相萃取柱中,以陽離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物為基質(zhì)的MCX 柱可提供雙重保留模式(即離子交換和反相保留),其填料在pH 0～14內(nèi)都很穩(wěn)定,且有很大的結(jié)合容量,常用于提取凈化需要高吸附量的生物基質(zhì)(如血液、尿液、膽汁及組織勻漿)中的堿性化合物。因此,試驗選擇MCX 陽離子交換柱為固相萃取柱。試驗中先用4 mL 0.1 mol·L－1鹽酸溶液水解、沉淀尿液和血液樣品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì),再經(jīng)高速離心后,上清液過MCX 固相萃取柱,將收集的洗脫液氮吹至近干,用初始流動相定容,過濾后檢測,效果較好。具體的前處理過程見1.3節(jié)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(M i)是指樣品中與目標物同時提取出來的物質(zhì)引起的目標物分析信號抑制或增強的現(xiàn)象。M i值可按式(1)進行量化評估。

式中:M i為正值時,基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為增強效應(yīng),反之減弱。當(dāng)M i的絕對值超過20%時,則認為基質(zhì)效應(yīng)對定量分析具有顯著影響,不可忽略。樣品中的各目標物經(jīng)過本方法處理后,M i的絕對值均小于10%,說明該方法無明顯的基質(zhì)效應(yīng)。各目標物具體的M i值見表2。

表2 基質(zhì)效應(yīng)Tab.2 Matrix effect

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

移取適量混合標準溶液和內(nèi)標溶液,用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.5,1.0,5.0,10.0,20.0,50.0μg·L－1的混合標準溶液系列,其中內(nèi)標芬太尼-d5的質(zhì)量濃度為10.0μg·L－1。按照儀器工作條件測定,以目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標,目標物與內(nèi)標芬太尼-d5的峰面積比值為縱坐標,采用加權(quán)(權(quán)重系數(shù)為1/x)最小二乘法進行回歸,求得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)Tab.3 Linearity parameters

結(jié)果表明,15種芬太尼類物質(zhì)的線性范圍均為0.5～50.0μg·L－1,相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),以10倍信噪比計算測定下限(10S/N)。結(jié)果表明,尿液、血液樣品中15種芬太尼類物質(zhì)的檢出限均為0.1μg·L－1,測定下限均為0.3μg·L－1。

2.6 精密度與回收試驗

分別在空白尿液和血液樣品中進行低(0.5μg·L－1)、中(25.0μg·L－1)、高(50.0μg·L－1)濃度水平的加標回收試驗,計算回收率;同時每個濃度水平平行測定6次,連續(xù)進樣6 d,計算測定值的相對標準偏差(RSD),得到日內(nèi)精密度和日間精密度,結(jié)果見表4。

表4 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表4 (續(xù))

由表4可知,15 種芬太尼類物質(zhì)的回收率為81.1%～113%,RSD 均小于15%,說明方法的回收率和精密度可以滿足實際工作中的檢測需求。

2.7 樣品分析

按照試驗方法分析6份不同來源的尿液和血液樣品,結(jié)果顯示15種芬太尼類物質(zhì)均未檢出。

本工作采用UHPLC-MS/MS同時測定尿液和血液樣品中15種芬太尼類新精神活性物質(zhì),通過固相萃取技術(shù)對樣品凈化富集,芬太尼-d5作為內(nèi)標定量,在16.0 min內(nèi)完成了對各化合物的分析測定。該方法前處理簡單、基質(zhì)效應(yīng)低、靈敏度高、選擇性好,適用于實際樣品的分析。但值得注意的是,芬太尼類新精神活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及代謝途徑相似,許多芬太尼類物質(zhì)有共同的代謝產(chǎn)物[11],這就使得鑒定結(jié)果的解釋更為復(fù)雜,需要結(jié)合尿液和血液中的原藥殘留和代謝成分,才能更好地對鑒定結(jié)果進行解釋。