許麥成，程新梅，馬呂麗

銀杏葉提取物調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠模型血脂的有效劑量研究

許麥成，程新梅*，馬呂麗

杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 311100

探索銀杏葉提取物（ginkgo leaf extracts，GBE）調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠模型血脂的有效劑量。SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、DBE（1.2、3.8、12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg?）組、非諾貝特（20 mg/kg）?組。除對(duì)照組，其余大鼠以高脂飼料飼養(yǎng)1周建立高脂血癥大鼠模型。除對(duì)照組和模型組，其余各組大鼠ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)6周。每2周檢測(cè)大鼠血清中三酰甘油（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。給予GBE 2、4、6周后對(duì)大鼠調(diào)血脂的最低有效劑量分別為37.9、12.0、3.8 mg/kg?；給予GBE（119.8、378.7 mg/kg）4、6周后對(duì)大鼠的調(diào)血脂作用無(wú)顯著差異。GBE用于短期治療高脂血癥的有效劑量為37.9～119.8 mg/kg（相當(dāng)60 kg成人每天用量為377.6～1 193.3 mg），用于預(yù)防或保健作用的最低劑量為3.8 mg/kg（相當(dāng)60 kg成人每天用量為37.8 mg）。

銀杏葉提取物；有效劑量；高脂血癥；三酰甘油；總膽固醇；低密度脂蛋白膽固醇；高密度脂蛋白膽固醇

銀杏葉提取物（ginkgo leaf extracts，GBE）作為食品補(bǔ)充劑，在美國(guó)連續(xù)多年處于銷(xiāo)量前10名，2018年銀杏葉制劑、保健食品和化妝品的全球市場(chǎng)總銷(xiāo)售額超過(guò)70億美元。文獻(xiàn)報(bào)道?[1]的GBE臨床前藥效學(xué)研究劑量和臨床使用劑量范圍極大，GBE調(diào)節(jié)大鼠血脂的最低劑量為4 mg/kg，最高劑量為5000 mg/kg。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，GBE作為膳食補(bǔ)充劑每人的最小劑量為2.5 mg/d，最大劑量為660 mg/d。我國(guó)原國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)顯示，GBE作為藥品的劑量為17.5～240 mg/d，作為保健食品的劑量為20～190 mg/d。GBE引發(fā)的不良反應(yīng)如內(nèi)出血?等，提示應(yīng)關(guān)注GBE臨床使用的劑量和療程，其不良反應(yīng)與劑量和療程呈正相關(guān)?[2-5]。本研究對(duì)GBE調(diào)血脂作用劑量進(jìn)行探索，旨在為其臨床合理使用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

GBE（棕褐色粉末，批號(hào)GBE-202-201401003）含總黃酮醇苷25.57%、萜類(lèi)內(nèi)酯6.62%、銀杏總酸1.24×10?6，購(gòu)自浙江紹興東靈保健食品有限公司；非諾貝特（批號(hào)18862，規(guī)格200 mg/粒）購(gòu)自法國(guó)Abott Labratories Limited公司；三酰甘油（triglycerides，TG）測(cè)定試劑盒（批號(hào)07010/00000210）、總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒（批號(hào)07014/00000267）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測(cè)定試劑盒（批號(hào)17411/00000152）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測(cè)定試劑盒（批號(hào)17410/00000156），購(gòu)自德國(guó)DiaSys Diagnostic Systems GmbH公司；高脂飼料（添加20.0%蔗糖、15.0%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉），購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠100只，7周齡，體質(zhì)量190～240 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)1609180003。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPS級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照明暗交替各12 h，通風(fēng)每小時(shí)大于15次，自由攝食與飲水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施條件合格證號(hào)SYXK（浙）2013-0188。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作遵循浙江省中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用規(guī)定，符合3R原則。

1.3 儀器

7020全自動(dòng)生化分析儀（日本日立株式會(huì)社）；L-550離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 劑量設(shè)定依據(jù)

GBE臨床用于調(diào)血脂的劑量中位數(shù)約為120 mg/d，根據(jù)60 kg成人體質(zhì)量的體表面積折算，相當(dāng)于200 g大鼠的劑量為12 mg/kg。以12 mg/kg作為中間劑量，以3.16倍級(jí)間距向下設(shè)置2個(gè)劑量：3.8、1.2 mg/kg?；向上設(shè)置3個(gè)劑量：37.9、119.8、378.74 mg/kg??[6]。

2.2 藥物配制

稱(chēng)定0.12、0.38、1.20、3.79、11.98、37.87 g GBE粉末，加1000 mL蒸餾水，攪拌混勻，分別配制成質(zhì)量濃度為0.12、0.38、1.20、3.79、11.98、37.87 mg/mL的溶液，于4 ℃保存。稱(chēng)定2 g非諾貝特，溶于1000 mL蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，于4 ℃冰箱保存。

2.3 高脂血癥大鼠模型的建立、分組與給藥

10只SD大鼠給予基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照組，其余大鼠給予高脂飼料1周后，眼內(nèi)眥采血，4000 r/min離心10 min，分離血清，測(cè)定血清中TC、TG水平。剔除血清TG＜3.0 mmol/L?、TC＜2.0 mmol/L的10只大鼠，將余下大鼠按TG、TC水平隨機(jī)分成模型組，GBE（1.2、3.8、12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg，按體表面積折算相當(dāng)于60 kg成人每天用量為12.0、37.8、119.5、377.6、1 193.3、3 770.9 mg）組和非諾貝特（20 mg/kg，相當(dāng)于人用劑量的6倍）組，每組10只。分組后各給藥組與模型組比較TC、TG水平均無(wú)顯著性差異，與對(duì)照組比較TC、TG水平有顯著差異，表明模型制備成功?[7]。

對(duì)照組大鼠給予維持飼料，其余各組給予高脂飼料。每天上、下午，各給藥組ig相應(yīng)藥物（5 mL/kg），模型組與對(duì)照組ig等體積生理鹽水，連續(xù)6周，每周測(cè)定并記錄大鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，麻醉后脫頸椎處死。

2.4 大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的檢測(cè)

每2周測(cè)定1次大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。給藥1 h后，各組大鼠眼內(nèi)眥采血，4000 r/min離心10 min，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 GBE對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響

如表1所示，各組大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異，表明GBE對(duì)大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯影響。

3.2 GBE對(duì)高脂血癥大鼠血清中TG和TC水平的影響

如圖1、2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TG、TC水平顯著升高（＜0.001）。與模型組比較，非諾貝特組第2、4、6周TG、TC水平均顯著降低（＜0.01、0.001）；GBE（37.9、119.8、378.7 mg/kg）組自第2周血清TG、TC水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），呈劑量相關(guān)性，但第4、6周無(wú)明顯劑量相關(guān)性；GBE（12 mg/kg）組自第4周TG、TC水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；GBE（3.8 mg/kg）組自第6周TG、TC水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.3 GBE對(duì)高脂血癥大鼠血清HDL-C、LDL-C水平的影響

如圖3、4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清HDL-C水平顯著降低（＜0.05），LDL-C水平顯著升高（＜0.001）。與模型組比較，非諾貝特組第6周HDL-C水平顯著升高（＜0.01），第4、6周LDL-C顯著降低（＜0.001）。GBE（119.8、378.7 mg/kg）組自第2周血清HDL-C水平顯著升高（＜0.01、0.001），LDL-C水平顯著降低（＜0.01、0.001）；GBE（37.9 mg/kg）組第4周血清HDL-C水平顯著升高（＜0.05、0.01），自第2周LDL-C水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；GBE（12 mg/kg）組第6周血清HDL-C水平顯著升高（＜0.05），LDL-C水平顯著降低（＜0.01）。

4 討論

本研究結(jié)果表明，給藥第2周，GBE（37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清TG、TC、LDL-C水平顯著降低，GBE（119.8、378.7 mg/kg）組血清HDL-C水平顯著升高，呈劑量相關(guān)性。給藥第4周，GBE（12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清TG、TC水平顯著降低，GBE（37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清HDL-C水平顯著升高，血清LDL-C水平顯著降低。給藥第6周，GBE（3.8、12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清TG、TC水平顯著降低，GBE（37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清HDL-C水平顯著升高，GBE（12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清LDL-C水平顯著降低。給藥第4、6周，GBE（119.8、378.7 mg/kg）組血清TG、TC水平與劑量無(wú)明顯相關(guān)性。以上結(jié)果表明，GBE用藥時(shí)間對(duì)藥效影響較大，用藥時(shí)間越長(zhǎng)，藥效越明顯。用藥2周GBE的最低有效劑量為37.9 mg/kg，用藥4周GBE的最低有效劑量為12.0 mg/kg，用藥6周GBE的最低有效劑量為3.8 mg/kg。當(dāng)療程大于4周，且劑量大于119.8 mg/kg時(shí)，提高劑量并不能增強(qiáng)療效。

GBE組和非諾貝特組大鼠血清TC、TG水平未恢復(fù)到正常水平，可能與模型大鼠用藥過(guò)程給予高脂飼料有關(guān)，提示適當(dāng)控制飲食有益于調(diào)血脂。Drago等?[8]研究結(jié)果顯示，與每日1次口服80 mg GBE比較，成人每日2次口服40 mg GBE，血藥濃度與時(shí)間曲線下面積（AUC）、半衰期（1/2）和平均滯留時(shí)間（mean residence time，MRT）均明顯提高，表明每日2次比每日1次給藥更有利于發(fā)揮藥效。本研究的最低有效劑量為3.8 mg/kg，低于文獻(xiàn)報(bào)道的最低有效劑量?[9-13]，可能與每日給藥2次且給藥時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。

GBE的臨床不良反應(yīng)涉及全身各系統(tǒng)，如出血（嚴(yán)重顱內(nèi)出血、嚴(yán)重蛛網(wǎng)膜下腔血、自發(fā)性前房出血、嚴(yán)重雙側(cè)硬膜下血腫），過(guò)敏反應(yīng)，高血壓，粒細(xì)胞減少，血管紅腫，癲癇發(fā)作，中樞神經(jīng)興奮，急性腸胃炎等?[13]。因此，GBE用于臨床治療時(shí)劑量不宜大于119.8 mg/kg（根據(jù)60 kg成人體質(zhì)量的體表面積折算，每日用量為1 193.3 mg），用于預(yù)防和保健時(shí)用量可低至3.8 mg/kg（根據(jù)60 kg成人體質(zhì)量的體表面積折算，每日用量為37.8 mg）。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on effective dosages of ginkgo leaf extracts on regulating blood lipid of hyperlipidemia rats

XU Mai-cheng, CHENG Xin-mei, MA Lyu-li

Hangzhou Huqing Yutang Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 311100, China

To study the effective dosages of ginkgo leaf extracts（GBE）on regulating blood lipid of hyperlipidemia rats.SD rats were randomly divided into control group, model group, GBE (1.2, 3.8, 12.0, 37.9, 119.8, 378.7 mg/kg) group and fenofibrate (20 mg/kg) group. Rats were feed with high-fat diet for one week to establish hyperlipidemia model except control group. Rats were igadministrated corresponding drugs except control and model group, once daily for six week. The levels of triglycerides (TG), total cholesterol (TC), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in serum of rats were measured every two week.After being given GBE for 2, 4, 6 weeks, the minimum effective dosages of GBE for regulating blood lipid in rats were 37.9, 12.0 and 3.8 mg/kg, respectively; GBE at dosages of 119.8 mg/kg and 378.7 mg/kg had no significant difference in regulating blood lipid in rats after 4 and 6 weeks,.The dosages of GBE in the short-term treatment of hyperlipidemia were 37.9—119.8 mg/kg?, which was equivalent to 377.6—1 193.3 mg for 60 kg adults per day), the minimum dose for preventive or health effects was 3.8 mg/kg?, which was equivalent to 37.8 mg for 60 kg adults per day).

ginkgo leaf extracts; effective dosage; hyperlipidemia; triglycerides; total cholesterol; low density lipoprotein cholesterol; high density lipoprotein cholesterol

R285.5

A

0253 - 2670(2021)02 - 0454 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.019

2020-11-16

許麥成，高級(jí)工程師，從事中藥制劑工藝和藥效學(xué)研究。Tel: (0571)86503610 E-mail: xxmmcc6505@sina.com

程新梅 Tel: (0571)86503627 E-mail: 379900738@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]