李永翔，蔣海嬌，郭建華

（齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

我國(guó)黃酒歷史悠久，是世界三大古酒之一，它主要以谷物（稻米、小米、玉米）為原料，利用曲藥作為糖化發(fā)酵劑進(jìn)行釀造，曲中所含微生物種類(lèi)繁多，既有細(xì)菌，也有霉菌、酵母等[1]。因此，研究玉米黃酒在發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及組成，能夠幫助我們更好地揭示在發(fā)酵過(guò)程中菌群的結(jié)構(gòu)變化，為今后分析微生物對(duì)于黃酒酒質(zhì)的影響打下基礎(chǔ)。

此前，有關(guān)微生物群落及其多樣性的研究主要基于傳統(tǒng)的微生物分離及純培養(yǎng)技術(shù)、熒光定量 PCR技術(shù)[2]、變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）[3]、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（TRFLP）[4]等。但上述研究方法往往難以得到確切的微生物種類(lèi)及其絕對(duì)含量。高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代測(cè)序方法，在微生態(tài)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用前景。聶志強(qiáng)等采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)食醋釀造過(guò)程中的原核微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)醋酸發(fā)酵過(guò)程中醋酸菌和乳酸菌是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醋酸菌的豐度不斷增加，乳酸菌卻在不斷減少[5]。趙景龍等用MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)清香型白酒發(fā)酵酒醅不同位點(diǎn)的細(xì)菌進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在不同位置酒醅中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相差較大，中心部位主要是Lactobacillaceae、Streptococcaceae 等厭氧或兼性厭氧細(xì)菌，靠近邊沿處則以好氧細(xì)菌居多[6]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)玉米黃酒發(fā)酵各個(gè)階段的群落結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律進(jìn)行研究，旨在為探索玉米黃酒釀制過(guò)程提供一定的理論依據(jù)，為后續(xù)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

玉米采用齊齊哈爾本地種植品種，酒曲（購(gòu)自廣西某地）。

1.2 方法

將干玉米脫胚破碎成直徑為2～5 mm 的顆粒，然后在55～60 ℃的水浴下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%～0.20%亞硫酸溶液浸泡50 h。蒸熟晾涼后接入曲種，前3 天在30 ℃下糖化發(fā)酵，之后投水在16 ℃條件下發(fā)酵，在發(fā)酵的第5 天進(jìn)行密封發(fā)酵。分別在發(fā)酵0, 3, 6, 12, 18, 24 d 取樣（下文樣本標(biāo)作0, 1, 2, 3, 4, 5），所有樣品-80 ℃保存，后送往上海凌恩生物科技有限公司，對(duì)樣品341F-806R 和ITS1F-ITS2R 區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序引物為341F，806R 以及ITS1F，ITS2F。引物序列為5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’，5’- GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’和5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。利用Illumina（MiSeq）平臺(tái)對(duì)獲得的序列進(jìn)行歸并分類(lèi)。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多樣性分析及組件樣本差異，根據(jù)每個(gè)樣本在各個(gè)分類(lèi)水平下具體組成，分析不同發(fā)酵時(shí)期樣本的群落組成及其動(dòng)態(tài)變化，并找出可能對(duì)玉米黃酒品質(zhì)有重要影響的菌群。

2 結(jié)果與討論

2.1 OTU 聚類(lèi)統(tǒng)計(jì)

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，在黃酒發(fā)酵各個(gè)階段的稀疏曲線如圖1 所示。

從圖1 可以看出，隨著測(cè)序量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，這反映了目前測(cè)序數(shù)量已滿足了樣本的多樣性。

圖1 黃酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌與真菌稀疏曲線

2.2 菌群多樣性分析

使用Mothur 軟件以97%相似度進(jìn)行歸并分析，利用得出的OTU 數(shù)進(jìn)行多樣性分析。從表1 中可以看出細(xì)菌Chao 值先下降，中期上升后再下降的趨勢(shì)，顯示出在發(fā)酵最初期時(shí)物種豐度最高，原因在于傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵工藝中，原料水并不需要滅菌操作，而且在前期攪拌過(guò)程中，器具及外界空氣也帶入了一部分微生物進(jìn)入，隨著發(fā)酵時(shí)間的持續(xù)，發(fā)酵產(chǎn)生的CO2使得微生物處于缺氧的環(huán)境，同時(shí)某些微生物代謝產(chǎn)生有機(jī)酸使pH 逐漸下降，酒精度逐漸上升，在這種不適宜微生物生長(zhǎng)的條件下，會(huì)抑制絕大部分微生物的生長(zhǎng)繁殖。Shannon 值的下降和Simpson 值的逐漸升高反映了群落的多樣性越來(lái)越低。

從真菌中可以看出Chao1 值先上升后下降，說(shuō)明了在發(fā)酵中期物種最為豐富。Shannon 值先上升后下降，Simpson 值先下降后上升，說(shuō)明了中期真菌多樣性較高，而在發(fā)酵末期菌群結(jié)構(gòu)越發(fā)簡(jiǎn)單。原因在于發(fā)酵末期微生態(tài)環(huán)境變化使得真菌的繁殖受到了抑制，降低了物種的多樣性。

表1 玉米黃酒發(fā)酵不同階段的細(xì)菌（a）和真菌（b）Alpha 多樣性

2.3 菌群結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 門(mén)，屬分類(lèi)水平下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

通過(guò)RDP Classifier 軟件對(duì)OTU 物種比對(duì)注釋顯示，玉米黃酒發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌主要屬于6 個(gè)菌門(mén)，26 個(gè)屬。

在門(mén)分類(lèi)水平下，變形菌門(mén)（Proteobacteria）細(xì)菌在發(fā)酵的全過(guò)程下始終屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，其豐度占到整個(gè)菌群的66.49%～86.91%。雖然擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）是第二大菌門(mén)，但其平均占比僅有9.96%～13.03%。此外放線菌門(mén)（Actinobacteria）占比只有1.99%～10.83%，排在第三。這表明，在玉米黃酒發(fā)酵全過(guò)程中，細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)高度不一。

在屬分類(lèi)水平下，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均一性同樣很低。本次檢測(cè)得到239 個(gè)菌屬，但其中只有前26 個(gè)屬的相對(duì)豐度大于整個(gè)菌群的1%。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，貪噬菌屬（Variovorax）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、產(chǎn)氫菌屬（Hydrobacter）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）一直處于相對(duì)優(yōu)勢(shì)占比。而其他菌屬在菌群占比均比較低，且在整體發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度變化不明顯，說(shuō)明發(fā)酵環(huán)境抑制了其生長(zhǎng)，大部分的微生物不能在高酸度，高乙醇濃度及厭氧環(huán)境下生存而逐漸消亡。

圖2 細(xì)菌在門(mén)水平（a）和屬水平（b）群落組成豐度分布圖

2.3.2 門(mén)，屬分類(lèi)水平下的真菌群落結(jié)構(gòu)

對(duì)黃酒發(fā)酵液中的真菌群落進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果顯示其真菌主要屬于2 個(gè)菌門(mén)，4 個(gè)屬。在門(mén)分類(lèi)水平下，子囊菌門(mén)（Ascomycota）占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度占比為97.43%～99.49%。擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）占比0.35%～2.61%。這也與欒同青[9]的研究結(jié)果相似[7]。

在屬分類(lèi)水平下，曲霉屬（Aspergillus）占比為18.09%～77.70%，塞伯林德納氏酵母屬（Cyberlindnera）占比為21.73%～75.35%，Kwoniella 屬占比為0.23%～2.05%，威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）占比為0.01%～3.56%。曲霉菌屬真菌在黃酒發(fā)酵過(guò)程中起到液化、糖化、蛋白質(zhì)分解的效果，同時(shí)形成還原糖、氨基酸、多肽等[8]。酵母菌屬在黃酒生產(chǎn)中產(chǎn)酯、產(chǎn)醇、產(chǎn)有機(jī)酸等風(fēng)味物質(zhì)，主要起生香作用[9]。

真菌的菌群結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單是由多方面因素造成的，如酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的酒精會(huì)對(duì)自身和其他真菌有毒害作用，曲霉屬代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸也會(huì)使真菌的生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生改變，使其不宜生長(zhǎng)繁殖。

圖3 真菌在門(mén)水平（a）和屬水平（b）群落組成豐度分布圖

3 結(jié)論

本次研究表明在發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌種類(lèi)要比真菌豐富。對(duì)微生物相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表明，變形菌門(mén)是黃酒發(fā)酵液中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，還有其它菌屬如擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)。而子囊菌門(mén)則是優(yōu)勢(shì)真菌，曲霉屬和酵母屬也被檢測(cè)到。在屬水平下貪噬菌屬、慢生根瘤菌屬、產(chǎn)氫菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比細(xì)菌屬較高，而曲霉屬、塞伯林德納氏酵母在真菌屬中占比較高。微生物直接影響著黃酒的品質(zhì)和風(fēng)格，因此針對(duì)微生物的研究將永不止步。