韓曉靜，于大慶，單婷玉，徐睿，查良平*，楊健

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 2300122.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700

赤芝最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，謂其“益心氣，補(bǔ)中，增慧智不忘”[1]。據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版記載，靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.) Karst.或紫芝G.sinenseZhao的子實(shí)體[2]。關(guān)于赤芝的產(chǎn)地，《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]、《本草綱目》[3]中均有記載：“赤芝生霍山”?；羯降靥幱诖髣e山北麓南北交界處，地理位置優(yōu)越，氣候溫和濕潤(rùn)?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝具有抗腫瘤、調(diào)血脂、抗氧化等作用[4-6]。隨著靈芝的藥用價(jià)值不斷被發(fā)掘，野生資源遠(yuǎn)不夠提供日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，栽培赤芝隨之大規(guī)模出現(xiàn)。越來越多的學(xué)者開始致力于野生靈芝和栽培靈芝活性成分的研究[7-8]。本課題組前期運(yùn)用顯微技術(shù)對(duì)霍山赤芝野生品和栽培品的外觀性狀和內(nèi)部構(gòu)造進(jìn)行了系統(tǒng)比較[9]，但其活性成分是否存在差異尚不明確。

代謝組學(xué)是以生物系統(tǒng)中的代謝產(chǎn)物為對(duì)象，通過高通量、高靈敏度、高分辨率的現(xiàn)代儀器，結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析方法，分析生物體代謝產(chǎn)物變化規(guī)律[10]。近年來，代謝組學(xué)方法和技術(shù)被廣泛地運(yùn)用于中藥現(xiàn)代化研究中，尤其是中藥活性成分研究、中藥整體藥效評(píng)價(jià)、中藥炮制機(jī)制研究和中藥安全性研究等方面[11-13]。目前，超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)常結(jié)合主成分分析(PCA)及聚類分析等方法，用于中藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)，且能對(duì)差異物質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。白璐等[14]采用UPLC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)研究遠(yuǎn)志不同品種間的化學(xué)成分差異，并篩選出13個(gè)差異代謝物。韓正洲等[15]基于UPLC-Q-TOF-MS建立了栽培型和野生型菊花的化學(xué)成分分析，表明兩者的化學(xué)組成存在差異，并篩選出木犀草素等9種差異化學(xué)成分。

本研究利用UPLC-Q-TOF-MS探尋霍山野生赤芝、仿野生赤芝和栽培赤芝的代謝組學(xué)差異，并對(duì)野生赤芝和栽培赤芝之間的差異代謝化合物進(jìn)行定性鑒定，以期為進(jìn)一步評(píng)價(jià)和鑒別栽培赤芝和野生赤芝的品質(zhì)提供參考。

1 材料

1.1 試藥

霍山赤芝栽培品“霍芝一號(hào)”、仿野生品來自于安徽霍山衡濟(jì)堂公司(安徽霍山縣黑石渡鎮(zhèn))，野生品來自安徽霍山大別山區(qū)。每類樣品均選5株，共15批樣品，對(duì)其菌蓋和菌柄分別進(jìn)行打粉。樣品經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷副研究員鑒定，均為多孔菌科靈芝屬真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.) Karst.。樣品編號(hào)中W表示野生，Ⅰ表示仿野生，C表示栽培，P表示菌蓋，S表示菌柄。WP1～WP5和WS1～WS5分別表示野生赤芝1～5號(hào)的菌蓋和菌柄，IP1～I(xiàn)P5和IS1～I(xiàn)S5分別表示仿野生赤芝1～5號(hào)的菌蓋和菌柄，CP1～CP5和CS1～CS5分別表示栽培赤芝1～5號(hào)的菌蓋和菌柄。

對(duì)照品靈芝酸C2(批號(hào)：98296-48-1)、赤芝酸A(批號(hào)：95311-94-7)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；靈芝酸D(批號(hào)：108340-60-9)購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司，以上對(duì)照品純度≥98%。色譜純甲醇、乙腈、甲酸(天津市康科德科技有限公司)。

1.2 儀器

ACQUITY UPLCTM I-Class系統(tǒng)(包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、EmpowerTM3型色譜工作站)、Xevo G2-S型Q-Tof四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；JK-5200B型超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)；EX225DZH型準(zhǔn)微量天平(奧豪斯儀器常州有限公司)；Legend Micro 21R型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；Direct-Pure型純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取干燥的栽培及野生、仿野生赤芝樣品粉末(過三號(hào)篩)各0.1 g，精密稱定，置2.0 mL離心管中，加入80%甲醇1.0 mL，密封，超聲提取40 min，4000 r·min-1離心10 min(離心半徑為6 cm)，取上清液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取靈芝酸C2、靈芝酸D、赤芝酸A對(duì)照品適量，加80%甲醇超聲溶解并定容，分別配制成含靈芝酸C2 1.15 mg·mL-1、靈芝酸D 1.03 mg·mL-1、赤芝酸A 1.08 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，存放于4 ℃冰箱中備用，臨用時(shí)用0.22 μm濾膜濾過。

2.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18型色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～2 min，20%～35%B；2～13 min，35%～50%B；13～18 min，50%～90%B)；運(yùn)行時(shí)間：18 min；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；分別采用正、負(fù)離子模式；掃描質(zhì)量數(shù)：m/z50～1500；碰撞氣體：氬氣；碰撞能量：60～90 eV；數(shù)據(jù)采用MakerLynx軟件處理。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.3和2.4項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)各主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行考察，計(jì)算RSD。

2.5.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h按2.3和2.4項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)各主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行考察，計(jì)算RSD。

2.5.3重復(fù)性試驗(yàn) 取霍山赤芝栽培品“霍芝一號(hào)”批次的赤芝樣品共6份，分別按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3和2.4項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)各主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行考察，計(jì)算RSD。

2.6 霍山野生及栽培赤芝代謝組數(shù)據(jù)采集

采集霍山野生及栽培赤芝樣品共30個(gè)，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以2.3和2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS測(cè)試，采集代謝組數(shù)據(jù)。

2.7 數(shù)據(jù)處理及多變量分析

UPLC-Q-TOF-MS采集獲得的原始數(shù)據(jù)(.raw)導(dǎo)入Progenesis QI(Waters Corp.公司)提取數(shù)據(jù)，該軟件包能夠自動(dòng)完成譜峰識(shí)別、濾噪等前處理程序，最終輸出保留時(shí)間、精確質(zhì)荷比組成的譜峰索引(變量)和峰強(qiáng)度/面積的三維數(shù)據(jù)矩陣。為校正質(zhì)譜響應(yīng)，每個(gè)樣品的總峰面積以Pareto標(biāo)度換算；標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)以SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行PCA，通過S-Plot判斷樣本的整體分布趨勢(shì)。

2.8 霍山野生及栽培赤芝差異代謝物的定性鑒定

經(jīng)Progenesis QI完成譜峰識(shí)別、匹配后，以SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，尋找霍山野生及栽培赤芝的組間標(biāo)志代謝物；并對(duì)標(biāo)志代謝物(差異代謝物)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性鑒定，以TOF-MS獲得的準(zhǔn)分子離子峰精確相對(duì)分子質(zhì)量信息、MS/MS獲得的二級(jí)碎片信息并結(jié)合保留時(shí)間與相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，最終確定差異代謝物的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 赤芝代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集方法的建立

基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)赤芝代謝物進(jìn)行正、負(fù)離子掃描，2種模式下的總離子流圖顯示，供試品中各化學(xué)組分在不同掃描模式下響應(yīng)強(qiáng)度不一，但總體上負(fù)離子模式下響應(yīng)峰較多，故采取負(fù)離子模式采集赤芝代謝組數(shù)據(jù)，見圖1。

圖1 赤芝80%甲醇水提取物總離子流圖(負(fù)離子模式)

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1精密度試驗(yàn) 對(duì)重復(fù)進(jìn)樣6次的供試品溶液色譜測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示，各主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.05%～0.36%，相對(duì)峰面積RSD為0.12%～1.68%，表明整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度良好。

3.2.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)相隔時(shí)間連續(xù)進(jìn)樣6次的供試品溶液色譜測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示，各主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.22%～0.85%，相對(duì)峰面積的RSD為0.49%～2.81%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.2.3重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)方法重復(fù)性進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，各主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.44%～1.76%，相對(duì)峰面積的RSD為0.59%～2.86%，表明該方法的重復(fù)性良好，符合植物代謝組學(xué)測(cè)定方法的要求。

3.3 霍山野生及仿野生、栽培赤芝代謝組PCA

通過UPLC-Q-TOF-MS采集得到的代謝組學(xué)信息數(shù)據(jù)具有樣品量多、數(shù)據(jù)信息復(fù)雜以及多維數(shù)據(jù)矩陣內(nèi)各變量之間具有高度相關(guān)性等特點(diǎn)，如何從這些“大數(shù)據(jù)”中篩選得到需要的信息，計(jì)算方法的選擇至關(guān)重要。PCA又稱主分量分析，是將多個(gè)具有復(fù)雜關(guān)系的變量通過線性變換從中篩選出較少個(gè)數(shù)重要變量的多元統(tǒng)計(jì)分析方法?！敖稻S”是PCA的基本思想，其原則是將很多有相關(guān)性的指標(biāo)，組合成新的互相無關(guān)的綜合指標(biāo)，從而來替代之前的指標(biāo)；保持之前的所有變量，盡量建立較少的新變量，讓這些新變量既互不相關(guān)又能保持之前的信息，從而反映出統(tǒng)計(jì)對(duì)象原有的“面貌”。本研究中，采用PCA對(duì)原始指標(biāo)進(jìn)行綜合，即以較少個(gè)數(shù)的主成分來反映原始指標(biāo)的主要信息；觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械慕M建分離趨勢(shì)，判斷其離合“面貌”。

從PCA得分圖(圖2)可以看出，在t[2]方向，WS1～WS5、WP1～WP5與IP1～I(xiàn)P5、IS1～I(xiàn)S5和CP1～CP5、CS1～CS5呈現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)，表明其代謝組之間存在顯著差異；IP、IS與CP、CS代謝組間差較小。在t[1]方向，野生赤芝、仿野生赤芝及栽培赤芝的菌柄與菌蓋之間均表現(xiàn)出顯著差異，表明赤芝不同部位之間的化學(xué)成分亦存在較大差異。其三維得分圖見圖3。

圖2 霍山野生赤芝、仿野生赤芝及栽培赤芝代謝組PCA得分圖

圖3 霍山野生赤芝、仿野生赤芝及栽培赤芝代謝組三維空間分布

3.4 霍山野生及栽培赤芝差異代謝物的定性鑒定

在預(yù)先知道樣本分類的情況下，可以將這些先驗(yàn)的類別信息整合到模式識(shí)別中，構(gòu)建有監(jiān)督的模式識(shí)別方式，通過綜合運(yùn)用類別指導(dǎo)信息和預(yù)處理后的變量集，篩選出有效的分類信息。偏最小二乘法(PLS)是一種新型的多因變量對(duì)多自變量的多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法，由于生物代謝物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的復(fù)雜性、不確定性和模糊性，經(jīng)常在實(shí)施PLS之前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行冗余處理；OPLS-DA就是應(yīng)用廣泛且有效的一種監(jiān)督性模式識(shí)別方法。該方法在PLS的基礎(chǔ)上，預(yù)先將X矩陣的每一列，即每一個(gè)變量與指導(dǎo)向量Y做相關(guān)分析。與Y相關(guān)性小，或正交的變量被認(rèn)為對(duì)Y指導(dǎo)下的分類的貢獻(xiàn)可以忽略，建模時(shí)不采用。與Y相關(guān)性足夠大的變量被保留，用于建模。

如圖4所示，經(jīng)過正交去噪后的監(jiān)督性分析方法OPLS-DA可更加明顯地區(qū)分霍山野生和栽培赤芝，模型的R2X、R2Y和Q2分別為0.289、0.953和0.822。組間差異代謝物的標(biāo)記通過下述4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：1)變量投影重要性(VIP)>2.0；2)相關(guān)系數(shù)(r)>0.80；3) Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)的P<0.001；4)曲線下面積(AUC)> 0.8。

圖4 霍山野生赤芝和栽培赤芝的OPLS-DA

如圖5所示，矩形框內(nèi)的為霍山野生和栽培赤芝的差異代謝物。通過TOF-MS獲得的準(zhǔn)分子離子峰精確相對(duì)分子質(zhì)量信息、同位素分布及MS/MS獲得的二級(jí)碎片信息并結(jié)合保留時(shí)間對(duì)其進(jìn)行鑒別(表1)，結(jié)構(gòu)見圖6。

圖5 霍山野生赤芝和栽培赤芝OPLS-DA差異成分分析結(jié)果散點(diǎn)圖

結(jié)果表明，霍山野生赤芝中有3個(gè)成分含量顯著高于栽培靈芝，分別為靈芝酸C2、靈芝酸D和靈芝酸A；栽培赤芝中有3個(gè)成分含量顯著高于野生靈芝，分別為赤芝酸A、赤芝酸E2和赤芝酸D。6個(gè)差異成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖6。

4 討論

TOF-MS定性最重要的線索是高分辨率的分子離子峰，再結(jié)合同位素模式，即可推斷化合物的分子式；最后結(jié)合MS/MS的碎片信息、保留指數(shù)、紫外吸收和文獻(xiàn)檢索等多種方法，最終對(duì)推斷出的化合物做到定性鑒定[16]。但是僅依靠質(zhì)譜方法進(jìn)行化合物定性有很大的局限性，其過于依賴代謝組數(shù)據(jù)采集的質(zhì)量。此外，對(duì)于同分異構(gòu)體或者具有類似質(zhì)譜裂解行為的化合物，僅依靠質(zhì)譜數(shù)據(jù)很難區(qū)分。

在本研究中，通過TOF-MS獲得的準(zhǔn)分子離子峰精確相對(duì)分子質(zhì)量信息、同位素分布及MS/MS獲得的二級(jí)碎片信息并結(jié)合保留時(shí)間對(duì)霍山野生和栽培赤芝的差異代謝物進(jìn)行定性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)霍山野生赤芝中有3個(gè)成分含量顯著高于栽培赤芝，分別為靈芝酸C2、靈芝酸D和靈芝酸A；栽培赤芝中有3個(gè)成分含量顯著高于野生赤芝，分別赤芝酸A、赤芝酸E2和赤芝酸D。為了確證霍山野生和栽培赤芝的差異代謝物結(jié)構(gòu)，通過與相應(yīng)對(duì)照品比對(duì)，最終確定差異代謝物的結(jié)構(gòu)和類別。本研究結(jié)果不僅為霍山栽培品赤芝和野生赤芝的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了重要的依據(jù)，也為進(jìn)一步研究赤芝提供了參考。

表1 霍山野生赤芝和栽培赤芝差異代謝物

圖6 霍山野生赤芝和栽培赤芝差異的三萜酸成分結(jié)構(gòu)式