賀成光朱篩成陳大業(yè)

(1.鹽城市婦幼保健院 小兒胸心外科, 江蘇鹽城 224000; 2.鹽城市婦幼保健院兒童心臟內(nèi)科, 江蘇 鹽城 224000)

支氣管肺發(fā)育不良( bronchopulmonary dysplasia, BPD)好發(fā)于早產(chǎn)兒中,該病是由因急性呼吸窘迫而進行較長時間的機械通氣干預以及輔助氧療導致的肺泡和肺內(nèi)血管發(fā)育受阻的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,其病死率較高,即使經(jīng)治療存活幼兒也極易承受反復呼吸到感染、肺動脈高壓、哮喘、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、生長遲緩以及喂養(yǎng)困難等合并多種并發(fā)癥,給患兒家庭以及社會帶來沉重負擔[1]。由于該病的病理機制較為復雜,尚未完全闡明,因此BPD 成為國際上新生兒科的一個巨大的挑戰(zhàn)。研究表明[2]大量的肺泡上皮細胞的異常凋亡致使肺泡結(jié)構(gòu)破壞是BPD 患兒肺損傷的基本病理改變。Zhang 等[3]研究表明抑制肺泡上皮細胞的凋亡能明顯改善急性肺損傷大鼠的肺損傷病理。Shah 等[4]研究證實多種蛋白因子參與BPD 肺泡上皮細胞的細胞凋亡。楊敏等[5]研究發(fā)現(xiàn)BPD 患兒支氣管灌洗液中轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factorβ1, TGF-β1)、克拉拉細胞分泌蛋白 16(clara cell secretory protein, CC16)、肺泡Ⅱ型細胞表面抗原-6(krebs yon denlungen-6, KL-6)存在異常的現(xiàn)象,可能參與患兒肺損傷的修復以及上皮細胞的凋亡。但未闡明 TGF-β1、CC16、KL-6 的表達與肺組織細胞的凋亡的機制。本研究通過建立新生大鼠BPD 模型,通過動態(tài)監(jiān)測其肺組織中 TGF-β1、CC16、KL-6的表達,以及肺組織細胞的凋亡情況,來探討TGF-β1、CC16、KL-6 的表達對肺組織細胞凋亡的影響,從而為BPD 的臨床研究提供實驗數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級新生 SD 雄性大鼠,1 日齡,體重 6.35 ～9.05 g,共計48 只,由江蘇神龍藥業(yè)有限公司提供[SCXK(蘇)2017-0007],飼養(yǎng)于揚州大學[SYXK(蘇)2019-0024]。本研究中所有動物實驗操作均在3R 原則的指導下給與動物人道主義關(guān)懷,本研究經(jīng)本院實驗動物管理倫理委員會審核批準(2020-079)。

1.2 主要試劑與儀器

TGF-β1、CC16、KL-6 抗體(德國 Rebstock 公司);兔抗大鼠磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 抗體(美國Santa公司);免疫組化試劑盒(南京建成生物有限公司);蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司);脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記(TdT-mediated dUTP nick labeling, TUNEL) 染色試劑盒(德國Roche 公司)。

LIOOS600T 生物顯微鏡(日本尼康公司);-80℃深冷冰箱(德國維根斯公司);Leica RM2135 組織切片機(德國Leica 公司);高速低溫離心機(北京六一儀器廠);OM-25ME 數(shù)字測氧儀(美國OMEGA公司);LVEM5 低電壓臺式透射電鏡(加拿大Delong America 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 BPD 模型構(gòu)建和分組處理

按隨機數(shù)字表法將新生鼠隨機分為對照組、模型組,每組24 只。BPD 的造模方法[6]:將新生鼠置于自制的密封的玻璃氧箱中,溫度在22℃～26℃,濕度在50%～60%,鈉石灰平鋪箱底以吸附CO2,平鋪變色硅膠以吸收水分,以數(shù)字測氧儀控制氧氣維持在80%～85%之間。模型組的氧箱每日定點開箱1 h,以更換鈉石灰以及變色硅膠。對照組新生鼠置于空氣中。所有新生鼠均由母鼠喂養(yǎng),所有母鼠每日以干凈水源、標準飼料喂養(yǎng);為防止母鼠在高氧環(huán)境中中毒死亡,每日定時交換模型組和對照組母鼠。記錄兩組新生鼠的體重、進食、死亡情況。每組在 7 d,14 d,21 d 時(簡稱為 7 d 模型組、14 d 模型組、21 d 模型組)隨機選出8 只新生鼠,誘導麻醉處死,留取血5 mL,打開胸腔無菌取出其肺部組織,置入深冷冰箱,待測。

1.3.2 ELISA 檢測各組新生鼠的血清中TGF-β1、CC16、KL-6 的水平

采用ELISA 試劑盒檢測各組新生鼠的血清中TGF-β1、CC16、KL-6 的水平,采用邁瑞全自動酶標儀MR-96 A 進行分析。

1.3.3 HE 染色觀察各組新生大鼠肺組織病理學改變

取出各組20%第7、14、21 天處死的大鼠肺臟組織,采用10%的甲醛固定24 h 切片,HE 染色觀察,光鏡下觀察病理改變。使用圖像分析軟件分析輻射狀肺泡計數(shù)(radial alveolar count, ROC),肺泡平均截距(mean linear intercept, MLI)[7]。

1.3.4 電鏡觀察各組新生大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變

取出10%第7、14、21 天處死的大鼠肺組織,制成超薄組織切片:采用2.5%聚甲醛預固定15 min,1%鋨酸固定20 min,環(huán)氧樹脂浸透包埋切片,醋酸雙氧鈾(uranyl acetate)及枸櫞酸鉛(lead citrate)染色,制成50 nm 切片,干燥后載與銅網(wǎng)上,電鏡觀察新生大鼠肺組織超微病理結(jié)構(gòu)改變。

1.3.5 TUNEL 染色檢測各組新生大鼠肺組織中的細胞凋亡

取出10%第7、14、21 天處死的大鼠肺組織,固定,冰凍切片,二甲苯浸洗,梯度乙醇浸洗,風干后3%雙氧水-甲醇浸泡,清洗,依次采用0.1%TritonX-100,0.1%緩沖液浸泡,清洗后,加入TUNNEL 反應(yīng)液,暗濕盒反應(yīng),漂洗,脫水,透明,封片,熒光顯微鏡進行觀察。

1.3.6 免疫組化檢測各組新生大鼠肺組織中TGF-β1、CC16、KL-6 的表達

取出20%第7、14、21 天處死的大鼠肺組織,10%多聚甲醛固定,石蠟包埋并切片,脫蠟,PBS 緩沖液修復。雙氧水浸泡,室溫下孵育,封閉,PBS 沖洗3 次,加入一抗(1∶500),4℃過夜孵育,次日沖洗干凈,分別加入二抗(1∶500),室溫孵育。顯色,蘇木素輕度復染,乙醇梯度脫水,二甲苯浸泡,中性樹膠封片,鏡檢觀察,在顯微鏡下目標蛋白被染成棕黃色顆粒[8]。

1.3.7 Western blot 檢測各組新生大鼠肺組織中TGF-β1、CC16、KL-6 的表達水平

取出20%第7,14,21 天處死的大鼠肺組織,采用常規(guī)方法提取目標蛋白 TGF-β1、CC16、KL-6,經(jīng)BCA 試劑盒測定蛋白濃度后,準確量取50 μg,電泳將蛋白分離,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉,以(1 ∶1500)比例稀釋后,維持4℃過夜孵育,次日,加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的二抗,經(jīng)顯色,曝光、顯影、定影后,以GAPDH 為內(nèi)參來表示蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 16.0 軟件,作圖工具采用Graphpad5.01,組間比較采用t檢驗,P<0.05 表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組新生鼠一般情況比較

對照組新生鼠精神狀態(tài)良好,斷奶后能夠自主進食,呼吸正常,皮毛濃密且富有光澤,未有死亡鼠出現(xiàn),存活率100%,體重明顯增加。模型組新生鼠精神狀態(tài)不加,容易煩躁,反應(yīng)速度較慢,進食較少,皮毛粗糙,暗淡,呼吸急促,體重增加量明顯比對照組少(P<0.05),有新生鼠因高氧而死亡,存活率為(60.35±3.42)%,見圖1。

2.2 兩組新生鼠肺組織損傷病理學改變

HE 染色結(jié)果如圖2 所示,正常組新生大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,細胞排列規(guī)整,未見充血、擴張、出血以及纖維增生現(xiàn)象,肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁厚度均勻,無水腫、增寬、滲出等現(xiàn)象,隨著日齡增長,肺泡大小趨向一致,肺泡間隔以及各級支氣管管腔內(nèi)均未內(nèi)未發(fā)現(xiàn)水腫、炎性細胞浸潤、分泌物滲出等現(xiàn)象。7 d 模型組新生大鼠肺組織纖維增生明顯,間質(zhì)水腫明顯,肺泡腔明顯變小,肺泡壁厚度不均一,間隔明顯增寬,腔內(nèi)出現(xiàn)炎性細胞填充;14 d模型組新生大鼠肺組織正常結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)實質(zhì)性灶點破壞,肺泡腔內(nèi)的炎性細胞明顯增多,肺間隔進一步加寬;21 d 模型組新生大鼠肺組織灶點性實變增多,局部呈現(xiàn)片狀病變,肺泡結(jié)構(gòu)的損傷進一步加重,小肺泡數(shù)量銳減,肺間質(zhì)內(nèi)膠原沉積增多。兩組大鼠的RAC 和MLI 比較如圖3 所示,與正常組相比,模型組大鼠肺組織在7 d,14 d,21 d 的RAC 明顯減少(P<0.05),MLI 明顯增加(P<0.05)。

注:A:正常組;B:模型組。與正常組相比,?P<0.05。圖1 兩組大鼠體重以及存活率比較Note.A, Normal group.B, Model group.Compared with normal group, ?P<0.05.Figure 1 The comparison of body weight and survival rate of two groups of rats

2.3 兩組新生鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)損傷改變

電鏡觀察結(jié)果如圖4 所示,正常組新生大鼠肺組織上皮細胞形狀規(guī)則,排列規(guī)整,Ⅱ型肺泡細胞板層小體清晰可辨,上皮細胞微絨毛結(jié)構(gòu)規(guī)整,隨著日齡的增加,成熟肺泡數(shù)量明顯增多;7 d 模型組新生大鼠肺組織的板層小體出現(xiàn)排空,上皮細胞的微絨毛結(jié)構(gòu)或缺失或破損;14 d 模型組新生大鼠的板層小體出已經(jīng)基本排空,線粒體空泡樣變性明顯,嵴結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷;21 d 模型組新生大鼠的板層小體基本消失,上皮細胞微絨毛結(jié)構(gòu)損傷更加嚴重,數(shù)量驟減,線粒體空泡樣變性加劇,嵴結(jié)構(gòu)明顯減少,或缺損,或消失。

2.4 TUNEL 染色檢測各組新生大鼠肺組織中的細胞凋亡

TUNEL 染色結(jié)果如圖5 所示,與正常組相比,模型組新生大鼠肺組織的細胞凋亡率隨日齡的增加明顯增加(P<0.05)。

2.5 各組新生大鼠新生鼠的血清中 TGF-β1、CC16、KL-6 的水平

ELISA 檢測結(jié)果如圖6 所示,與正常組相比,模型組新生大鼠血清中TGF-β1、KL-6 的含量隨日齡增加而明顯增加(P<0.05),CC16 的含量隨日齡增加而明顯降低(P<0.05)。

2.6 免疫組化Western blot 檢測各組新生大鼠肺組織中 TGF-β1、CC16、KL-6 的表達

免疫組化結(jié)果如圖7 ～9 所示:與正常組相比,模型組大鼠肺組織TGF-β1、KL-6 的陽性細胞比例隨日齡增加明顯升高(P<0.05),CC16 的陽性細胞比例明顯降低(P<0.05)。

注:A:正常組;B1:7 d 模型組;B2:14 d 模型組;B3:21 d 模型組。圖2 HE 染色結(jié)果Note.A, Normal group.B, Model group.B1, 7 d model group.B2, 14 d model group.B3, 21 d model group.Figure 2 The results of HE staining

2.7 Western blot 檢測各組新生大鼠肺組織中TGF-β1、CC16、KL-6 的表達水平

Western blot 結(jié)果如圖10 所示:與正常組相比,模型組大鼠肺組織TGF-β1、KL-6 的表達隨日齡增加明顯升高(P<0.05),CC16 的表達明顯降低(P<0.05)。

注:A:正常組;B1:7 d 模型組;B2:14 d 模型組;B3:21 d 模型組。與正常組相比,?P<0.05。圖3 P 兩組新生大鼠RAC 和MLI 比較Note.A,Normal group.B,Model group.B1,7 d model group.B2,14 d model group.B3,21 d model group.Compared with normal group,?P<0.05.Figure 3 The comparison of RAC and MLI of two groups of newborn rats

2.8 模型組肺組織中 TGF-β1、CC16、KL-6 的表達與其肺組織細胞凋亡率的相關(guān)性

模型組新生鼠肺組織中 TGF-β1、KL-6 的表達與肺組織的細胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.977、0.970,P均=0.000),CC16 的表達與細胞凋亡率呈現(xiàn)負相關(guān)(r=-0.982,P=0.000),見圖11。

3 討論

作為一種在低胎齡產(chǎn)兒中最常見的慢性肺部疾病,BPD 的主要臨床病理[9]改變表現(xiàn)為肺泡數(shù)量減少,體積增加,肺泡次級間隔縮短等肺泡結(jié)構(gòu)破壞致使肺泡和肺微血管發(fā)育障礙,肺功能異常。盡管近來的圍生醫(yī)學,氧療技術(shù),新生兒的管理技術(shù)的不斷提高以及機械通氣策略的改進,但是BPD 仍無根治性治療措施,在新生兒中具有較高的致殘率和致死率[10]。因此深入研究BPD 的發(fā)病機制,對臨床上BPD 的治療以及遠期預后影響深遠。

注:A:正常組;B1:7 d 模型組;B2:14 d 模型組;B3:21 d 模型組。圖4 電鏡觀察結(jié)果Note.A, Normal group.B, Model group.B1, 7 d model group.B2, 14 d model group.B3, 21 d model group.Figure 4 The observation results under electron microscope

注:A:正常組;B1 ∶7 d 模型組;B2:14 d 模型組;B3:21 d 模型組。與正常組相比,?P<0.05;與 7 d 模型組相比,#P<0.05;與 14 d 模型組相比,##P<0.05。下同。圖5 TUNEL 染色結(jié)果Note.A, Normal group.B, Model group.B1, 7 d model group.B2, 14 d model group.B3, 21 d model group.Compared with the normal group,?P<0.05.Compared with the 7 d model group, #P<0.05.Compared with the 14 d model group, ##P<0.05.The same as below.Figure 5 The results of TUNEL staining

圖6 各組新生大鼠血清中 TGF-β1、CC16、KL-6 的水平Figure 6 The levels of TGF-β1, CC16 and KL-6 in serum of newborn rats in each group

圖7 免疫組化檢測大鼠肺組織中TGF-β1 的表達Figure 7 Immunohistochemical detection of the expression of TGF-β1 in the lung tissues of rats

圖8 免疫組化檢測各組大鼠肺組織中CC16 的表達Figure 8 Immunohistochemical detection of the expression of CC16 in the lung tissues of rats

圖9 免疫組化檢測各組大鼠肺組織中KL-6 的表達Figure 9 Immunohistochemical detection of the expression of KL-6 in the lung tissues of rats

圖10 Western blot 結(jié)果Figure 10 Results of Western blot

圖11 模型組大鼠肺組織中TGF-β1、CC16、KL-6 的表達與肺組織的細胞凋亡率的相關(guān)性Figure 11 Correlation between the expression of TGF-β1, CC16, KL-6 in the lung tissue of the model group and the apoptosis rate of the lung tissue

高氧機械持續(xù)通氣是危重早產(chǎn)兒搶救中的常用措施,但由于早產(chǎn)兒的肺泡和肺微血管的發(fā)育尚未完善,長時間的高氧暴露會產(chǎn)生高氧肺損傷,誘發(fā)BPD[11]。本研究通過高濃度氧暴露來建立新生大鼠BPD 模型,分別在7 d,14 d,21 d 處死新生鼠進行追蹤觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組健康生長,發(fā)育良好,未有死亡鼠出現(xiàn),存活率100%。模型組新生鼠精神不振,發(fā)育遲緩,體重增加量不明顯,有新生鼠因高氧而死亡,存活率僅有(60.35±3.42)%。RAC是反映哺乳動物終末呼吸時成熟肺泡的數(shù)量,是衡量肺發(fā)育成熟與否的重要指標;代表肺泡腔內(nèi)徑大小的MLI 是評價肺間質(zhì)水腫程度的常用指標[12]。本研究中模型組的HE 病理顯示和超微結(jié)構(gòu)觀察模型組新生鼠的肺組織損傷、肺部超微結(jié)構(gòu)損傷程度隨氧暴露時間的持續(xù)而逐漸加重。與正常組相比,模型組大鼠肺組織在7 d,14 d,21 d 的RAC 明顯減少(P<0.05),MLI 明顯增加(P<0.05),說明隨氧暴露的時間的延長,模型組新生鼠的成熟肺泡的數(shù)量明顯減少,出現(xiàn)肺發(fā)育不良的癥狀。

大量的動物實驗研究顯示[13]肺泡上皮細胞的異常凋亡是BPD 患兒肺泡數(shù)量減少的關(guān)鍵因素。Cai 等[14]研究證實抑制肺組織尤其是肺泡上皮細胞的凋亡,能夠明顯改善早產(chǎn)兒BPD 肺損傷病理,促進肺組織的發(fā)育。但是針對BPD 潛在的細胞凋亡機制尚不明確,國內(nèi)外眾多的研究學者致力于闡明BPD 的分子病理發(fā)生機制。TGF-β1 是多種器官包括肺、肝、腎等致纖維化的關(guān)鍵因子。研究顯示[15]早產(chǎn)患兒肺組織中存在TGF-β1 過度表達的現(xiàn)象。Jin 等[16]研究顯示異常表達的TGF-β1 促進新生大鼠肺組織肺泡上皮細胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強成纖維細胞的趨化活性,加重新生大鼠肺組織的纖維化損傷。CC16 是細支氣管粘膜上皮細胞分泌的具有抗炎、抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)等生物活性的肺相關(guān)性蛋白。Lin 等[17]研究報道血清中CC16 的水平是評價哮喘、慢性阻塞性肺病以及肺感染等肺部疾病中肺-血屏障通透性,反映肺泡毛細血管損傷的重要指標。Guzmán-Bárcenas 等[18]報道 CC16 的表達可作為生物標志物,對BPD 的治療以及遠期預后具有潛在的價值。KL-6 是在在Ⅱ型肺泡上皮細胞中定位表達的炎性因子。Dilli 等[19]臨床研究證實血漿中KL-6 的水平對于早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良的預測具有潛在的診斷價值。本研究中研究發(fā)現(xiàn),模型組新生鼠肺組織的細胞凋亡率隨氧暴露時間的延長而增加,血清中 TGF-β1、CC16、KL-6 的水平以及肺組織中 TGF-β1、CC16、KL-6 的表達隨之升高。相關(guān)性分析顯示模型組新生鼠肺組織中TGF-β1、KL-6的表達與肺組織的細胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.977、0.970,P均=0.000),CC16 的表達與細胞凋亡率呈現(xiàn)負相關(guān)(r=-0.982,P=0.000)。

綜上所述,TGF-β1、CC16、KL-6 參與 BPD 肺組織的細胞凋亡。這為下一步開展BPD 的基因治療提供了新的靶向位點,但是如何控制血清中TGF-β1、CC16、KL-6 的水平,以及如何針對 TGF-β1、CC16、KL-6 位點開展對BPD 的個體化治療還需更深入的研究。