董博思邱湘苗賴婉琳李宛凌彭安嬌陳 蕾

(四川大學華西醫(yī)院神經內科,成都 610041)

癲癇是一種常見的由多種病因所致的發(fā)作性神經系統(tǒng)疾病,為了了解其復雜的生理病理機制,探究相關遺傳因素及開發(fā)抗癲癇藥物(antiepileptic drugs, AEDs),人們建立了癲癇動物模型。最初的模型是Jackson 等人于1869 年在狗身上建立的[1],在此基礎上各種理化因素誘導的動物模型根據不同的研究目的被建立。本文將目前已有的癲癇動物模型的誘發(fā)方式、優(yōu)缺點、主要應用、改良方式等做一總結。

1 常見癲癇模型的行為學特征及優(yōu)缺點

常用癲癇建模方法及應用見表1。

1.1 化學藥物

常用的化學點燃方式可通過直接在動物腦內注射低劑量的興奮劑,或通過反復系統(tǒng)應用閾下濃度的驚厥劑來誘發(fā)癲癇。由于點燃可以精確地確定癲癇發(fā)作的時間、癲癇發(fā)作的部位,故可提供癲癇傾向性、反復癲癇發(fā)作對大腦的影響、不同結構在調節(jié)癲癇持續(xù)時間和擴散中的作用、不同區(qū)域相對易感性等大量信息。當然它也有一定的缺點:局部刺激可能無法預測其他部位的后果;在正常動物中進行的癲癇可能與癲癇動物的發(fā)作結果不同,且不同品系、年齡、性別動物對這些化學致癇劑及AEDs 反應存在差異[2];點燃也是一個昂貴和耗時的過程,包括植入物丟失、損壞的風險。此外,許多化合物在全身給藥時也能產生急性全面性起源發(fā)作,如3-巰基丙酸、β-咔啉、美解眠等。這些模型的共同優(yōu)點是制作簡單,雖然致癇機制稍有不同,但藥物的選擇通常主要取決于研究者的熟悉程度[3]。該類模型對我們了解從刺激性癲癇到癲癇持續(xù)狀態(tài)的轉變有哪些變化,癲癇在什么時候加重并導致腦損傷,以及如何預防等問題至關重要。

1.1.1 戊四氮(pentylenetetrazol, PTZ)

化學藥品中最經典的便是通過阻斷GABA 傳遞致癇的PTZ,可用于建立急、慢性癲癇動物模型。在嚙齒類動物中以閾值劑量注射PTZ 可導致急性肌陣攣和緊張性擴張;而以較低的閾下劑量重復給藥可引起點燃現(xiàn)象,其最初的非驚厥劑量可降低實驗動物的死亡率,同時大多數(shù)動物都能誘發(fā)癲癇活動,如無需后續(xù)藥物干預的改良window-PTZ 點燃法[4],但少見明顯苔蘚纖維發(fā)芽及自發(fā)性癲癇發(fā)生[5]。此外,低劑量 PTZ(20 ～30 mg/kg)可引起失神發(fā)作,適合于相關AEDs 篩選[6]。

1.1.2 紅藻氨酸(kainic acid, KA)

KA 是一種從紅藻中提取的L-谷氨酸神經毒類似物,對海馬具有特別突出的毒性作用,并呈劑量依賴性,故以中小劑量常用[7]。腦內注射KA 可用于研究致癇灶對周圍和正常腦組織的影響,而全身注射KA 通常用來研究大腦多個區(qū)域對癲癇發(fā)生的易感性和藥物研究。在此基礎上的KA 快速點燃法可節(jié)約時間、藥品成本且具有永久性[8],KA 模型在潛伏期、行為癥狀、潛伏期持續(xù)時間以及潛伏期和慢性期的腦電圖特征等方面與人類相似[9],有助于我們更好地了解顳葉癲癇過程,開發(fā)更有效的靶向治療藥物。此外,用KA 靶向注射小鼠腹側海馬可建立一個在癲癇發(fā)作和認知表型與標準背側海馬模型相似的顳葉癲癇模型,但具有明顯的情感特征,可用于進一步研究顳葉癲癇的重要共病[10]。

1.1.3 匹羅卡品

毛果蕓香堿(匹羅卡品)誘導癲癇的能力可能取決于M1 受體的激活,并可在癲癇發(fā)作后可引起海馬谷氨酸水平升高及NMDA 受體激活,從而維持癲癇發(fā)作[11]。該模型具有反復自發(fā)性發(fā)作、典型海馬硬化、苔蘚纖維發(fā)芽等特點[12]。匹羅卡品模型相較于上述藥物發(fā)作更加持久,更可靠、實驗時間更短及成本最低。雖然其腦電圖特征和神經病理學改變與KA 相似,但全身應用匹羅卡品后,可觀察到丘腦、黑質、大腦皮質等更廣泛的形態(tài)學病變,但須考慮到系統(tǒng)性使用KA 也可能會導致海馬外區(qū)域損傷,且顳葉癲癇患者也會有海馬外神經元損傷的表現(xiàn)。此外,鋰-毛果蕓香堿模型不僅可減少匹羅卡品劑量,也顯示出與人類持續(xù)性癲癇非常相似的表現(xiàn),杏仁核電刺激代替鋰預處理也可得到類似效果[13]。

1.1.4 金屬

通過損傷皮層制備癲癇模型應用最為廣泛的便是植入金屬,其中最具有代表性的是涂抹鋁乳膏的動物模型。該模型發(fā)作間期和發(fā)作期腦電圖與臨床局灶性癲癇相似,偶爾會進展為繼發(fā)性全面強直陣攣性發(fā)作,且該模型對標準AEDs 的反應也與局灶性癲癇患者相同[14]。雖然植入金屬模型是慢性局灶性癲癇的良好模型,但制備難度大、成本高。另外,鐵離子導入蛛網膜下腔動物模型與皮層或杏仁核注射相比,雖不適合作為人類難治性癲癇的藥物及發(fā)病機制研究,但其早期誘發(fā)出癲癇強烈,成功率高(95%),且能模擬人類蛛網膜下腔出血所產生的癲癇,操作起來也相對容易[15]。

1.1.5 青霉素

低劑量青霉素誘導局灶性癲癇模型適用于研究癲癇發(fā)作活動擴散的分析[16],但青霉素模型更常用于模仿具有抗藥性的失神發(fā)作,且PTZ、光刺激和GABA 能激動劑可加劇發(fā)作。但給嚙齒動物肌注時,不會持續(xù)產生與貓相似的雙邊同步棘慢波發(fā)放(spike wave discharges, SWDs),相反地會產生多灶性尖峰。不過用青霉素預處理大鼠后,可增加其他化學藥物誘導SWDs[17],對研究與棘慢波發(fā)放相關的細胞機制與在產生棘慢波爆發(fā)時皮質對皮質下結構的作用非常有用。

1.1.6 AY-9944

AY-9944 是一種抑制7-脫氫膽固醇降解為膽固醇的化合物,是目前唯一永久性的不典型失神模型,其誘導機制尚不完全清楚,不過為膽固醇在抑制癲癇發(fā)生的作用提供思路。另外AY 結合抗有絲分裂劑(methylazoxymethanol acetate, MAM)可模擬伴有腦發(fā)育不全的難治性不典型失神發(fā)作[18]。該模型在可靠性、自發(fā)性、復發(fā)性和誘發(fā)癲癇的慢性發(fā)作方面比遺傳模型相更具優(yōu)勢,但在識別和量化實驗性失神發(fā)作所需腦電圖監(jiān)測方面要求更高。

1.1.7 γ-羥基丁酸鹽(γ-hydroxybutyrate, GHB)

GHB 模型是公認的失神發(fā)作模型,可觀察到雙側同步的與行為停止、面部肌陣攣和顫動抽搐有關的SWDs[19]。使用有生物活性的GHB 前體(GBL)可產生與GHB 完全相同的腦電圖和行為效應,但其效應相對更持續(xù)和迅速。

1.2 物理方法

1.2.1 電刺激

一種局灶性癲癇發(fā)作模型是通過直接電刺激皮質產生的,重復電脈沖會導致腦急劇放電[20]。另一種更常用的是通過電點燃數(shù)周后,動物可表現(xiàn)出自發(fā)癲癇發(fā)作。對于電刺激參數(shù),通常認為電刺激間隔時間才是關鍵變量,在波寬1 ms, 頻率60 Hz,刺激時間為1 s 的標準條件下,間隔15 min 到7 d都能引出點燃,但間隔15 ～30 min 需要更多次刺激才能點燃[21]。在此基礎上一種快速電點燃模型可使苔蘚纖維發(fā)芽發(fā)展更快,減少動物痛苦[22]。

由于電點燃法需要先進的外科手術和腦電圖技術,6 Hz 角膜點燃法成為了一種簡單有效的替代方法。該模型在顯性表現(xiàn)和腦電圖模式上與精神運動性癲癇具有高相似性;也被認為是耐藥性癲癇潛在治療藥物的篩選工具[23]。然而,電點燃與海馬硬化癥無關,損傷與顳葉癲癇也不相似,自發(fā)癲癇相對藥物發(fā)生較少。

最大電休克(maximal electroshock, MES)是目前研究全面性發(fā)作最透徹、最適宜使用的模型。因為MES 和PTZ 制備方法簡單,且有比較高的篩選AEDs 的效率,故MES 模型和PTZ 模型通常是作為初次篩選癲癇藥物的金標準。但MES 模型對作用于離子型通道的藥物有偏向性,易導致其他AEDs(如氨基己酸、噻加賓等)被忽略[24]。

此外Hunter 等[25]人的研究顯示刺激內丘腦可產生類似失神表現(xiàn)和腦電圖,但是由于需要長期置入電極需不斷刺激,且死亡率相對較高,而很少使用于制造失神模型。

1.2.2 低溫

低溫損傷模型是一種不需要將外源性藥物注入體內也可以引起局灶性癲癇的模型。這種液氮探針可造成致癇病灶伴隨腦水腫發(fā)生,發(fā)作可持續(xù)數(shù)天,具有可重復性,死亡率較低(<5%),可發(fā)生自發(fā)性癲癇,但動物年齡、系統(tǒng)給藥對該模型驚厥閾值的影響還不清楚[17]。

1.3 遺傳模型

一些神經元煙堿乙酰膽堿受體基因(CHRNA4,CHRNB2,CHRNA2)和KCNT1 引起常染色體顯性遺傳性夜間額葉癲癇和LGI1 與具有聽覺特征的常染色體顯性遺傳性癲癇的嚙齒類動物模型[26]使得遺傳因素在局灶性癲癇中的重要作用現(xiàn)已得到充分證實。而利用遺傳性模型來研究人類全面發(fā)作也被認為是目前最有希望的途徑之一[3],主要有光敏性狒狒Papio Papio 模型、遺傳性癲癇易感鼠聽源性模型、個體差異較大的癲癇易感沙土鼠(MG)等模型。此外,遺傳因素在失神發(fā)作的發(fā)病機制中也發(fā)揮著重要作用,但大多數(shù)品系的小鼠與在WAG/Rij大鼠身上觀察到的相反,并沒有自發(fā)的SWDs,而當觀察到SWDs 時,通常伴發(fā)其他神經系統(tǒng)疾病,如嗜睡小鼠(l h/l h)、Tottering 鼠、Stargazer 鼠、Ducky 鼠等[27]。研究人員還發(fā)現(xiàn)一些品系還具有其他特性,適宜用來研究癲癇與抑郁等其他疾病的關系,并有助于制定治療這些共病的新治療策略[28]。然而,自然界發(fā)現(xiàn)的癲癇動物不能確保一定是研究所篩選的基因引起的,目的性地敲除或過表達所要研究的基因、制作出特定的小鼠基因模型越來越受歡迎(見表2)。但特定的基因表達可能導致任何年齡的動物死亡,如果轉基因DNA 隨機插入基因組,在多達5%的轉基因品系中會發(fā)生中斷或干擾內源性基因的表達,而這種插入突變產生的潛在表型是不可預測的,明顯干擾了研究對轉基因本身表達產生癲癇的解釋。

1.4 新生兒驚厥模型

新生兒驚厥動物模型有助于研究自發(fā)性發(fā)作的潛伏期和降低癲癇發(fā)作閾值,有望用于探究預防癲癇發(fā)作的方法,也適宜進行細胞培養(yǎng)用于體外研究。目前主要有缺氧缺血(hypoxia-ischemia, HI)和熱性驚厥(febrile seizures, FSs)模型成功復制了新生兒驚厥發(fā)作的一些結構異常和認知功能障礙?，F(xiàn)快速缺血缺氧模型可沒有明顯腦損傷,且各品系之間差別微小[29]。但FS 不涉及明顯的神經元丟失[30],且動物癲癇發(fā)作是由高溫引起的,這些都與人類的疾病過程不同;而HI 模型在更年幼(P5)和成年(P60)大鼠通常不會發(fā)作[31],這其中可能涉及其他機制。

此外,上述藥物或技術可聯(lián)合使用以實現(xiàn)各種模型優(yōu)勢互補。有研究發(fā)現(xiàn)苯環(huán)定(phencyclidine,PCP)對125 mg/kg NMDA 引起癲癇表現(xiàn)沒有干擾,但可大大降低動物死亡率[32];聯(lián)合鎮(zhèn)靜劑與感覺刺激可產生無人工制品使用和腦損傷的模型,用于研究反射性癲癇產生和傳播機制,以及評價AEDs[33];還有在應用基因工程技術增加動物癲癇易感性的基礎上,用點燃等方式誘發(fā)癲癇來研究遺傳機制等。

表1 常見動物模型制備Table 1 The summary of models of seizures and epilepsy

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 基因小鼠模型Table 2 The summary of genetic models

基因Gene功能Function突變方式Mutation type表型Phenotype or syndrome in mice人類對應基因突變后表型Phenotype or syndrome in human Cacna 1a Chrna4 Chrnb2電壓依賴性鈣通道 α1 A 亞基Voltage dependent calcium channel α 1 A subunit煙堿型乙酰膽堿受體Nicotinic acetylcholine receptor煙堿型乙酰膽堿受體Nicotinic acetylcholine receptor突變Spontaneous敲入Knock in(KI)轉基因Transgene失神發(fā)作,共濟失調Absence epilepsy, ataxia尼古丁誘發(fā)癲癇的閾值降低Reduced threshold to nicotine induced seizures自發(fā)性癲癇Spontaneous seizures家族性偏癱偏頭痛;原發(fā)性全面性癲癇伴共濟失調及輕度學習困難;失神發(fā)作Familial hemiplegic migraine (FHM); Primary generalized epilepsy, ataxia, mild learning difficulties; absence epilepsy常染色體顯性夜間額葉癲癇Autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy (ADNFLE)常染色體顯性夜間額葉癲癇ADNFLE Gabrb3 γ 氨基丁酸 A 受體GABAA Gabrg2 GABA 受體 γ2 亞基GABAγ2敲除KO敲除KO肌陣攣及偶發(fā)性癲癇發(fā)作;腭裂Myoclonus and occasional epileptic seizures;cleft palate癲癇發(fā)作約4 周后死亡Epilepsy,lethality around 4 week腭裂;Angelman 綜合征、Prader-Willi 綜合征相關癲癇發(fā)作Cleft palate; Human Rearrangements of 15q11-q13 Angelman syndrome (AS) and Prader-Willi syndrome (PWS)-associated seizures全身癲癇伴熱驚厥發(fā)作Generalized epilepsy with febrile seizures plus(GEFS+)Gad2谷氨酸脫羧酶-2 Glutamate decarboxylase-2敲除KO自發(fā)性癲癇(死亡率高)Spontaneous seizures,increased mortality-Glra1 甘氨酸受體, α1 Glycine receptor, α 1 Kcna1 電壓門控K 通道Voltage gated K+ channel Kcnc2 電壓門控K 通道Voltage gated K+ channel Kcnq2 電壓門控K 通道Voltage gated K+ channel敲入KI敲除KO敲除KO有條件的顯陰性的轉基因Conditional dominant-negative Kcnq2 transgene癲癇發(fā)作約3 周死亡;驚跳病Seizures and lethality by 3 week; hyperekplexia成年后自發(fā)性癲癇Frequent spontaneous seizures through adult life自發(fā)性強直陣攣性發(fā)作Spontaneous tonicclonic convulsions自發(fā)性癲癇伴海馬形態(tài)改變Spontaneous seizures,behavioral hyperactivity and morphologic changes in the hippocampus驚跳病Hyperekplexia強直陣攣及單純部分性癲癇發(fā)作Tonic-clonic and simple partial seizures-良性家族性新生兒癲癇Benign familial neonatal convulsions (BFNC)Lgi1 Scn1a Scn1b富亮氨酸膠質瘤失活Inactivation of leucine rich glioma電壓門控鈉通道Voltage gated Na+ channel電壓門控鈉通道Voltage gated Na+ channel敲除KO敲除KO敲除KO自發(fā)性癲癇Spontaneous seizures自發(fā)性癲癇Spontaneous seizures自發(fā)全面性癲癇Spontaneous generalized seizures伴聽覺特征的常染色體顯性遺傳癲癇Autosomal dominant epilepsy with auditory features Drave 氏綜合征;全身癲癇伴熱性驚厥DS; GEFS+全身癲癇伴熱性驚厥GEFS+

續(xù)表2

2 模擬特殊病因模型的行為學特征及優(yōu)缺點

2.1 外傷

目前創(chuàng)傷后癲癇動物模型都是模仿創(chuàng)傷后晚期癲癇發(fā)作,即初始損傷后超過一周發(fā)生癲癇,主要用于探究創(chuàng)傷后癲癇發(fā)病機制、認知缺陷與細胞死亡、治療等方面。流體沖擊損傷是創(chuàng)傷后癲癇最廣泛使用和研究最深入的模型,可模仿創(chuàng)傷性腦損傷相關的組織病理學,且在傷后1 年內表現(xiàn)出持續(xù)的神經運動和認知缺陷,但該模型缺乏對治療藥物有效性的預測;控制性皮質撞擊可模仿急性硬膜下血腫、軸突損傷、血腦屏障功能障礙等,數(shù)周后癲癇易感性增加,表現(xiàn)為與顳葉癲癇相關的特征,但需要復雜的技術裝置;加速沖擊模型相對制造簡單且造成損傷嚴重程度易控制,但再現(xiàn)可靠率低,死亡率高,不能產生自發(fā)性發(fā)作[62]。

2.2 微生物感染

雖然病毒、寄生蟲等感染模型有炎癥和神經元死亡、高興奮性和行為性癲癇的證據,可用于相關腦炎治療藥物的檢測,但因模型的高死亡率和癲癇活動的變異性,不適于AEDs 的檢測。

2.3 腦腫瘤

癲癇發(fā)作頻率和發(fā)生率與腫瘤的位置、病理特征和病變進展有關,故而了解腫瘤性癲癇的病因是準確有效治療的前提。目前通常將鼠C6 膠質瘤細胞移植到穩(wěn)定轉染綠色熒光蛋白(GFP)基因的大鼠的皮質中進行造模,在組織學上類似于人類膠母細胞瘤的彌漫性侵襲性膠質瘤[17]。

2.4 腦卒中

腦卒中后癇性發(fā)作模型是確定發(fā)作關鍵步驟或途徑并制定預防卒中后癇性發(fā)作干預策略的關鍵,目前尚無標準的動物模型,主要因為技術要求高、病變的大小和分布不一、死亡率高。近年來光血栓模型備受關注,其癇性發(fā)作發(fā)生在光血栓形成數(shù)周后,在海馬區(qū)可發(fā)現(xiàn)苔蘚狀纖維,死亡率相對較低[63]。

3 展望

動物模型除了應用于探究癲癇機制及AEDs外,當代社會一些環(huán)境對癲癇患者發(fā)作的影響也值得探究制作相關的癲癇動物模型來進行研究。有研究發(fā)現(xiàn)在一次嚴重的空氣污染事件中,癲癇的急救呼叫明顯增加[64];居民暴露于道路交通噪聲和空氣污染與高熱驚厥的風險增加有關[65];睡眠紊亂和低氧狀態(tài)也可以導致航空飛行中癲癇發(fā)作[66];基礎實驗也有發(fā)現(xiàn)噪聲暴露下的豚鼠神經遞質GABA及下丘的電生理發(fā)生改變[67],提示噪聲暴露會導致中樞聽覺相關通路的損傷;妊娠期小鼠暴露在空氣細顆粒物下不僅影響胚胎神經發(fā)育,而且通過干擾神經發(fā)生/膠質形成事件、髓鞘形成和突觸發(fā)生,干擾小鼠出生后大腦的生長和成熟[68]。這些都提示一些特殊環(huán)境下的癲癇模型制備有重要的研究意義。

綜上所述,在揭示癲癇發(fā)生的基本機制、確定藥物治療特定癲癇類型和預防癲癇發(fā)展的療效等方面,這些動物模型發(fā)揮了關鍵的作用。但我們很難設計一個能概括癲癇所有特征的動物模型,而且目前的模型都不完美,故應意識到各種模型的局限性。但需要強調的是,動物模型應該是復雜系統(tǒng)的簡單表示,模擬疾病的特定方面,而決不是試圖復制具有人類疾病的所有復雜性。因此,無論何時使用動物模型,定義一個特定的問題并確保所選模型符合目的,根據目的制造和選擇模型才是至關重要的。