熊 玥，劉建暉，石慧慧，汪云花，孫 瑤

(江蘇省獸藥飼料質(zhì)量檢驗所,南京 210036)

板青顆粒收載于《中國獸藥典》2015年版二部，由板藍(lán)根、大青葉兩味中藥煎煮濃縮后，與適量蔗糖、糊精混合制粒而成[1]。方中板藍(lán)根、大青葉均可清熱解毒，板藍(lán)根重在涼血利咽，大青葉偏于涼血消斑，二藥合用，共奏清熱解毒、涼血之功。臨床上廣泛用于畜禽風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、熱病發(fā)斑等溫?zé)嵝约膊〉姆乐蝃2]。目前板青顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對滯后，僅有理化顯色鑒別及精氨酸的薄層鑒別，專屬性不強(qiáng)，無指標(biāo)性成分的定性鑒別及定量測定，且精氨酸的薄層鑒別方法在實際檢驗中存在一定的問題，很難對板青顆粒質(zhì)量的優(yōu)劣進(jìn)行全面評價，導(dǎo)致市場上的板青顆粒質(zhì)量參差不齊，也給假劣產(chǎn)品混入提供了可乘之機(jī)。本研究參考文獻(xiàn)報道[3-9]及《中國獸藥典》2015年版二部中板藍(lán)根和大青葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下的有關(guān)方法[1]，以精氨酸、脯氨酸、亮氨酸、靛玉紅為專屬性成分，建立薄層色譜鑒別方法；以尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷為指標(biāo)性成分，建立高效液相色譜定性及定量測定方法，完善板青顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并利用新建立的方法對市售的17批次樣品進(jìn)行了評價性研究，為《中國獸藥典》2020年二部中板青顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了實驗數(shù)據(jù)。

1 儀器與材藥

1.1 儀器 半自動點樣器(Linomat 5型，瑞士Camag公司)；薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(TLC Visualizer型，瑞士Camag公司)；高效液相色譜儀(ACQUITY Arc型，美國Waters公司，配PDA檢測器和Empower 3工作站)；電子天平(XA105DU型，瑞士Mettler Toledo公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DV型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 甲醇(色譜級，德國Merck公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純(南京化學(xué)試劑有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)。精氨酸對照品(批號140685-201707，含量99.9%)、亮氨酸對照品(批號140687-201905，含量99.9%)、脯氨酸(批號140677-201808，含量99.9%)、靛玉紅對照品(批號110717-201805，含量99.6%)、尿苷對照品(批號110887-201803，含量99.5%)、鳥苷對照品(批號111977-201501，含量93.6%)、(R,S)-告依春對照品(批號111753-201706，含量100.0%)、腺苷對照品(批號110879-201703，含量99.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院；除自制的3批板青顆粒(批號：20200223、20200304、20200325)外，另收集市售樣品17批次(來源批號等信息見表6)。

2 方法及結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 氨基酸的薄層色譜鑒別 取本品研細(xì)的粉末1 g，加乙醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液自然揮發(fā)至約2 mL，作為供試品溶液。另取精氨酸對照品、脯氨酸對照品、亮氨酸對照品適量，加乙醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為混合對照品溶液。照薄層色譜法(《中國獸藥典》2015年版二部 附錄0502)試驗，吸取上述混合對照品溶液2 μL、供試品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(19∶7∶5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，結(jié)果見圖1。

S．亮氨酸、脯氨酸、精氨酸(從上至下) S1．大青葉陰性對照 S2．板藍(lán)根陰性對照1～5．板青顆粒

2.1.2 靛玉紅的薄層色譜鑒別 取本品研細(xì)的粉末10 g，加二氯甲烷50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。另取靛玉紅對照品適量，加二氯甲烷制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國獸藥典》2015年版二部 附錄0502)試驗，吸取上述對照品溶液5 μL、供試品溶液10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-丙酮(5∶4∶2)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖2。

S．靛玉紅 S1. 板藍(lán)根陰性對照 S2．大青葉陰性對照1～5．板青顆粒

2.1.3 尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷的高效液相色譜定性鑒別 取“2.2.3”項下制備的溶液，作為供試品溶液。另取“2.2.2”項下制備的溶液，作為混合對照品溶液。按“2.2.1”項下的色譜條件試驗，采用二極管陣列檢測器(PDA)進(jìn)行全波長掃描，記錄混合對照品溶液及供試品溶液在210～400 nm的吸收光譜圖，提取245 nm波長處的色譜圖。結(jié)果，在供試品色譜中，呈現(xiàn)與4種對照品色譜峰保留時間一致的色譜峰，且各峰的吸收光譜圖與相應(yīng)對照品一致，見圖3。

圖3 混合對照品(A)和板青顆粒(B)的高效液相色譜定性鑒別光譜指數(shù)圖

2.2 4 種指標(biāo)性成分的定量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 SHISEIDO Capcell Pak C18 MG色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；甲醇(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫(0～15 min，3%～5% A；15～20 min，5%～10% A；20～23，10%～13% A；23～38 min，13% A)；流速為0.8 min·mL-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為245 nm；進(jìn)樣量為10 μL；理論板數(shù)按(R,S)-告依春計算應(yīng)不低于5000，供試品圖譜中尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷與其他組分均能達(dá)到基線分離，見圖4。

1.尿苷 2.鳥苷 3.(R,S)-告依春 4.腺苷

2.2.2 對照品溶液的制備 取尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷對照品適量，精密稱定，加5%甲醇溶液制成每1 mL含尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷分別為10 μg、10 μg、3 μg 和10 μg的混合對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加5%甲醇溶液70 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，用5%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別取尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷對照品適量，精密稱定，用5%甲醇溶液溶解并稀釋制成含尿苷為108.06 μg·mL-1、鳥苷為101.09 μg·mL-1、(R,S)-告依春為31.44 μg·mL-1和腺苷為105.18 μg·mL-1的混合對照品貯備溶液。精密吸取對照品貯備液適量，加5%甲醇溶液分別稀釋制成含尿苷32.42、21.61、10.81、5.40、2.16、1.08 μg·mL-1，含鳥苷30.33、20.22、10.11、5.05、2.02、1.01 μg·mL-1，含(R,S)-告依春9.43、6.29、3.14、1.57、0.79、0.39 μg·mL-1，含腺苷31.56、21.04、10.52、5.26、2.10、1.05 μg·mL-1的系列溶液，按擬定色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，以對照品的濃度為橫坐標(biāo)(x)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

2.2.5 檢測限和定量限 精密量取已知質(zhì)量濃度的對照品溶液，用5%甲醇溶液依次稀釋制成濃度由高到低的系列溶液，測得尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷的檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，用質(zhì)量單位表示，見表1。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各峰相對保留時間的RSD(n=6)<0.1%，尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷各峰面積的RSD(n=6)分別為0.4%、0.3%、0.4%和0.4%，方法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取樣品(批號20200223)按“2.2.3供試品溶液的制備”項下操作，平行制備6份，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，測得每1 g供試品中尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷的平均含量分別為583、599、150、449 μg，RSD(n=6)分別為0.4%、0.6%、1.0%和0.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品(批號20200223)溶液，分別在0、2、4、8、12、24、48、72 h按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄供試品溶液中尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷的色譜峰保留時間及峰面積，各峰保留時間RSD(n=8)<0.1%，峰面積RSD(n=8)分別為0.9%、1.0%、1.6%和0.6%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 回收率試驗 取已知含量的板青顆粒(批號20200223)細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，按供試品已知成分含量的50%、100%、150%三個水平分別加入濃度為尿苷54.03 μg·mL-1、鳥苷50.54 μg·mL-1、(R,S)-告依春15.72 μg·mL-1和腺苷52.59 μg·mL-1的混合對照品溶液5、10、15 mL。按“2.2.3”項下操作并進(jìn)樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果樣品中尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷的平均回收率分別為98.6%、100.5%、98.5%和99.8%，RSD(n=9)分別為1.0%、1.3%、1.1%和1.4%。見表2～5。

表1 回歸方程、線性范圍、定量限和檢測限

表2 板青顆粒中尿苷加樣回收率

表3 板青顆粒中鳥苷加樣回收率

表4 板青顆粒中(R,S)-告依春加樣回收率

表5 板青顆粒中腺苷加樣回收率

2.2.10 含量測定 取研磨后的板青顆粒細(xì)粉約2 g，精密稱定，按“2.2.3”項下操作，制成供試品溶液。分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，按外標(biāo)法以峰面積計算供試品中尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春和腺苷的量，結(jié)果見表6。

表6 板青顆粒4種成分含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論與結(jié)論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇 方中板藍(lán)根為十字花科菘藍(lán)IsatisindigoticaFort．的干燥根，主要含有生物堿類、核苷類、氨基酸類等化學(xué)成分[10-12]?！吨袊F藥典》2015年版二部中板藍(lán)根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)選擇精氨酸進(jìn)行薄層色譜鑒別，以(R,S)-告依春為指標(biāo)成分進(jìn)行薄層色譜鑒別和高效液相色譜定量測定，可實現(xiàn)與南板藍(lán)根的快速鑒別。大青葉與板藍(lán)根同出一源，為菘藍(lán)的干燥葉，與板藍(lán)根所含化學(xué)成分基本一致[13-14]，但不同化學(xué)成分在兩者中含量差距較大。大青葉現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以靛藍(lán)、靛玉紅為指標(biāo)成分進(jìn)行薄層色譜鑒別，并采用高效液相色譜法對靛玉紅進(jìn)行定量測定。本研究結(jié)合板青顆粒的臨床功效，建立以靛玉紅為代表的吲哚類成分薄層色譜鑒別方法；建立以(R,S)-告依春為代表的生物堿及以尿苷、鳥苷和腺苷為代表的核苷類成分的高效液相色譜定性定量測定方法。上述幾種化合物在熱水中溶解性好，用水煎煮提取時能夠很好的溶出，且具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒活性[15-16]，故可作為指標(biāo)性成分來控制該制劑的質(zhì)量。

3.2 精氨酸薄層鑒別的改進(jìn) 按照現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的鑒別2進(jìn)行精氨酸薄層鑒別時，經(jīng)常會出現(xiàn)供試品溶液的精氨酸斑點相比精氨酸對照品的斑點滯后的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響結(jié)果的判定。楊新等研究表明[17]，板青顆粒的輔料蔗糖易溶于提取液稀乙醇，后在加熱蒸干過程中被水解成還原糖，還原糖會進(jìn)一步與供試品中的氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)(Maillard Reaction)，形成大分子物質(zhì)類黑精，導(dǎo)致薄層板上斑點滯后。本研究利用蔗糖在乙醇中溶解度很低的特性，采用乙醇做提取液，用自然揮發(fā)代替加熱蒸干進(jìn)行供試品溶液的制備，減少了供試品溶液中蔗糖的含量及還原糖的產(chǎn)生，有效解決了斑點滯后問題。

3.3 HPLC法定性及定量實驗條件的選擇 參考文獻(xiàn)考察多種流動相，選擇甲醇和水梯度洗脫，各峰分離度好。比較了Shim-pack VP-ODS柱，Capcell Pak C18 MG柱、Waters Atlantis T3柱等，樣品溶液中(R,S)-告依春、尿苷、鳥苷和腺苷均可達(dá)到基線分離，選擇245 nm作為檢測波長時，各被測色譜峰均有較好的響應(yīng)值。本研究預(yù)實驗表明4種被測組分可使用不同的提取方法及展開條件進(jìn)行TLC鑒別，但考慮到HPLC測定含量時，一針進(jìn)樣可同時檢測4種成分，使用PDA檢測器采集光譜圖，將保留時間及光譜匹配度作為判定指標(biāo)，亦可對4種成分進(jìn)行定性鑒別，相比薄層色譜法前處理簡單，受其他因素影響小。

3.4 評價性研究結(jié)果分析及建議 將自制樣品及市場收集的17批樣品按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測，均符合規(guī)定。用新建立的方法進(jìn)行檢測，20批樣品中僅有14批能夠進(jìn)行(R,S)-告依春定量測定，其余6批均未測得或低于檢測限，含量范圍在0～538.2 μg·g-1；尿苷的含有量范圍在10.7～613.2μg·g-1；鳥苷的含有量范圍在0～673.2 μg·g-1；腺苷的含有量范圍在0～520.5 μg·g-1。結(jié)果表明不同生產(chǎn)企業(yè)，同一生產(chǎn)企業(yè)的不同批次之間，4種成分含量差異很大。分析原因，首先是不同產(chǎn)地藥材本身的差異性[18-21]，藥材中有效成分的含量直接影響制劑的質(zhì)量。殷世寧等對不同產(chǎn)地的18批次板藍(lán)根中尿苷、腺苷、(R,S)-告依春3種成分進(jìn)行測定，(R,S)-告依春為0.034～0.347%，腺苷為0.001～0.079%，尿苷為0.010～0.051%；其次是否按照處方足量投料也直接關(guān)系成品含量；最后不同生產(chǎn)企業(yè)使用的提取工藝或制劑制法的差異，亦導(dǎo)致某些成分轉(zhuǎn)移率較低[22]。參考《中國獸藥典》中藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則，含有量限度按照20批樣品含量測定結(jié)果(表6)的平均值下浮20%計算，建議規(guī)定本品每1 g含尿苷、鳥苷和腺苷的總量不得少于0.46 mg；含(R,S)-告依春不得少于0.075 mg。

中獸藥通過“多成分、多作用、多靶點”在我國獸醫(yī)醫(yī)療系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，且不易產(chǎn)生耐藥性，是國家實施獸用抗菌藥使用減量化行動可行的抗菌藥替代方法之一，其主成分含量的差異會直接導(dǎo)致臨床療效的優(yōu)劣。板青顆粒作為臨床常用中獸藥，療效確切，但其質(zhì)量控制水平還比較落后，不利于日常監(jiān)管。綜上所述，建議《中國獸藥典》2020版完善板青顆粒的鑒別項、增加含量測定項，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)支持。