溫芳，張秀英，郭桂芳，陸連壽，萬仁玲，郝利華，鞏忠福

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

馬拉硫磷是一種較早應(yīng)用的有機(jī)磷殺蟲劑,主要以觸殺、胃毒合熏蒸毒殺滅害蟲，具有廣譜、低毒、使用安全等特點(diǎn)。我國、美國及歐盟等均批準(zhǔn)其作為獸藥使用，美國[1]和歐盟[2]已將馬拉硫磷及其制劑收錄入藥典中，并可提供馬拉硫磷及其雜質(zhì)的對(duì)照品，我國已將精制馬拉硫磷原料及制劑收錄入2017年版《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)》[3](化學(xué)藥品卷)中，但還未提供相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

為控制馬拉硫磷產(chǎn)品質(zhì)量，滿足獸藥產(chǎn)品檢驗(yàn)需求，本研究參照美國藥典、歐洲藥典以及我國2017年版《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)》(化學(xué)藥品卷)擬定了馬拉硫磷對(duì)照品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)馬拉硫磷對(duì)照品候選物進(jìn)行了全面質(zhì)量控制，并以美國藥典委員會(huì)提供馬拉硫磷對(duì)照品作為溯源對(duì)照品，通過協(xié)作標(biāo)定方法對(duì)馬拉硫磷對(duì)照品候選物進(jìn)行定值，經(jīng)專家組審查，現(xiàn)已入庫發(fā)放，填補(bǔ)了我國獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的一項(xiàng)空白。

1 材料與方法

1.1 材料 馬拉硫磷對(duì)照品(批號(hào)：1374408，含量99.2%)和異馬拉硫磷對(duì)照品(批號(hào)：1349604，含量97%)，美國藥典委員會(huì)提供；馬拉硫磷對(duì)照品候選物(純度99.2%)，山東省化學(xué)農(nóng)藥及中間體產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站提供；甲醇、丙酮，色譜純；水為符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水；高效液相色譜儀e2695，美國waters公司提供；氣相色譜儀7890A，Agellent公司提供；XP105天平，METTLER公司提供；787KFTitrino水分測(cè)定儀，瑞士萬通公司提供。

1.2 方法

1.2.1 相對(duì)密度 按《中國獸藥典》(2015版)一部[4]相對(duì)密度測(cè)定方法中的比重瓶法測(cè)定。

1.2.2 鑒別

1.2.2.1 取本品 2 mL，加甲醇2 mL，搖勻，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，搖勻，靜置2 min，再加0.5 mol/L硫酸溶液數(shù)滴，使溶液呈無色，加醋酸銅試液2 mL，生成深黃色沉淀；

1.2.2.2 高效液相方法 在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，馬拉硫磷對(duì)照品候選物溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與馬拉硫磷對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。

1.2.3 檢查

1.2.3.1 游離酸 取本品約2 g，精密稱定，加無水乙醇20 mL和溴酚藍(lán)指示液數(shù)滴，搖勻，用氫氧化鈉滴定液(0.02 mol/L)滴定至溶液為藍(lán)色，同時(shí)以空白試驗(yàn)校正。

1.2.3.2 異馬拉硫磷[1-2]色譜條件：照含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)波長為210 nm，異馬拉硫磷和馬拉硫磷的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.5和1.0。

測(cè)定法：精密稱取異馬拉硫磷對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含0.1 mg的異馬拉硫磷對(duì)照品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密稱取馬拉硫磷對(duì)照品候選物適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含20 mg的馬拉硫磷溶液，同法測(cè)定。平行測(cè)定2份異馬拉硫磷對(duì)照品和2份馬拉硫磷對(duì)照品候選物，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算馬拉硫磷對(duì)照品候選物中異馬拉硫磷含量。

1.2.3.3 水分測(cè)定方法 按照《中國獸藥典》(2015版)一部[4]水分測(cè)定法第一法費(fèi)休氏法進(jìn)行。

1.2.4 含量測(cè)定方法 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：用高效液相方法測(cè)定[1-3]。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(30 cm×3.9 mm,10 μm)；以甲醇-水(50∶30)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為254 nm；流速1.0 mL/min。理論板數(shù)按馬拉硫磷峰計(jì)算不低于2500，與相鄰峰的分離度應(yīng)符合要求。

測(cè)定法：精密稱取馬拉硫磷對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含10 mg馬拉硫磷對(duì)照品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；精密稱取馬拉硫磷對(duì)照品候選物適量，同法配制并測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算馬拉硫磷對(duì)照品候選物中馬拉硫磷含量。平行測(cè)定2份馬拉硫磷對(duì)照品和5份馬拉硫磷對(duì)照品候選物。

1.2.5 定值方法 協(xié)作標(biāo)定方法： 3家單位協(xié)作標(biāo)定；含量測(cè)定按照1.2.4 高效液相方法進(jìn)行；每家單位均由2人進(jìn)行測(cè)試；每人測(cè)試平行樣不少于5份(每人測(cè)試用對(duì)照品至少應(yīng)取2份)；單人平行樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于0.5%，2人間的相對(duì)偏差應(yīng)小于0.3%。3家單位協(xié)作標(biāo)定，測(cè)定結(jié)果進(jìn)行加權(quán)平均計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 相對(duì)密度 測(cè)定結(jié)果為1.23。

2.2 鑒別

2.2.1 生成深黃色沉淀；

2.2.2 馬拉硫磷對(duì)照品 候選物溶液主峰保留時(shí)間為16.999，馬拉硫磷對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間為16.994，保留時(shí)間一致。圖譜見圖3和圖4。

2.3 檢查

2.3.1 游離酸 用空白試驗(yàn)校正后，測(cè)得游離酸的結(jié)果為0.02%；

2.3.2 異馬拉硫磷 將濃度約為0.1 mg/mL的2份異馬拉硫磷對(duì)照品溶液和濃度約為20 mg/mL的2份馬拉硫磷對(duì)照品候選物溶液，分別進(jìn)樣2針。異馬拉硫磷和馬拉硫磷的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.5和1.0。按外標(biāo)法計(jì)算馬拉硫磷對(duì)照品候選物中異馬拉硫磷的含量，其平均值為0.06%，修約為0.1%，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。異馬拉硫磷對(duì)照品圖譜見圖1，馬拉硫磷對(duì)照品候選物圖譜見圖2。

表1 馬拉硫磷對(duì)照品候選物中異馬拉硫磷含量測(cè)定結(jié)果

圖1 異馬拉硫磷對(duì)照品圖譜

圖2 馬拉硫磷對(duì)照品候選物圖譜

2.3.3 水分測(cè)定結(jié)果 用3份重蒸水標(biāo)定費(fèi)休氏試液，得F值為3. 564 5；測(cè)定3份供試品的水分平均值為0.1%。

2.3 含量測(cè)定結(jié)果

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果 將濃度約為10 mg/mL的馬拉硫磷對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5針，其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%，理論塔板數(shù)大于2500，與相鄰峰的分離度符合方法要求。

2.3.2 含量測(cè)定結(jié)果 將濃度約為10 mg/mL的2份馬拉硫磷對(duì)照品溶液和5份馬拉硫磷對(duì)照品候選物溶液，分別進(jìn)樣2針，按外標(biāo)法計(jì)算5份馬拉硫磷對(duì)照品候選物的含量，其含量平均值為98.77%，修約為98.8%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該候選物滿足制備馬拉硫磷對(duì)照品原料的要求。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。馬拉硫磷對(duì)照品圖譜見圖3，馬拉硫磷對(duì)照品候選物圖譜見圖4。

圖3 馬拉硫磷對(duì)照品圖譜

圖4 馬拉硫磷對(duì)照品候選物圖譜

表2 馬拉硫磷對(duì)照品候選物含量測(cè)定結(jié)果

3 定值結(jié)果

3.1 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果、加權(quán)平均計(jì)算結(jié)果和合并計(jì)算結(jié)果分別見表3、表4和表5：

表3 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果匯總表

表4 3家單位協(xié)作標(biāo)定結(jié)果的加權(quán)平均值

表5 3家單位標(biāo)定結(jié)果加權(quán)平均值的合并計(jì)算

3.2 定值結(jié)果 對(duì)3家單位協(xié)作標(biāo)定結(jié)果進(jìn)行加權(quán)平均計(jì)算，得出馬拉硫磷對(duì)照品候選物含量的加權(quán)平均值為98.99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%，修約為99.0%，所以本研究制備的馬拉硫磷對(duì)照品含量賦值為99.0%。

4 討論與結(jié)論

WHO發(fā)布的化學(xué)對(duì)照品一般指導(dǎo)原則規(guī)定用于含量測(cè)定用對(duì)照品需要至少3家實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定；中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制定的《獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范(試行)》也規(guī)定新獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用溯源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值時(shí)，原則上應(yīng)由2個(gè)以上(含2個(gè))外部實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定，所以本次制備的馬拉硫磷對(duì)照品采用外標(biāo)法，由3家單位協(xié)作標(biāo)定來定值，保證了馬拉硫磷對(duì)照品含量賦值的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

我國2017年版《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)》(化學(xué)藥品卷)收錄的馬拉硫磷原料含量測(cè)定方法為氣相法，但在研究過程中發(fā)現(xiàn)，通過改變柱溫、氣體流速、分流比等色譜條件[5]，馬拉硫磷主峰中仍有1小峰未能完全分離，所以用氣相方法測(cè)定馬拉硫磷含量存在定量準(zhǔn)確性的問題，所以本研究參照美國藥典和歐盟藥典用高效液相方法作為制備馬拉硫磷對(duì)照品的含量測(cè)定方法。

當(dāng)對(duì)照品用于專屬性的含量測(cè)定方法時(shí)，確定雜質(zhì)的含量是很重要的。本研究參照美國藥典及歐盟藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)增加了對(duì)雜質(zhì)異馬拉硫磷的質(zhì)量控制，保證了馬拉硫磷對(duì)照品含量定值結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3家單位協(xié)作標(biāo)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%，滿足用高效液相方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。