田愷，張浩然，張亦菲，徐汀，華賢輝，商軍

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

精制馬拉硫磷溶液屬于有機(jī)磷殺蟲藥，主要以觸殺、胃毒和熏蒸殺滅蟲害，具有廣譜、低毒、使用安全等特點(diǎn)，多用于牛羊皮毛去虱除蟲，其作為獸用殺蟲藥劑，廣泛應(yīng)用于牛羊產(chǎn)地多的地區(qū)。目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)馬拉硫磷的方法主要有電化學(xué)法[1-2]、酶聯(lián)免疫法[3]、分光光譜法[4]、氣相色譜法[5-10]、液相色譜法[11-13]、氣質(zhì)聯(lián)用法[14]和液質(zhì)聯(lián)用法[15]等，其中氣相色譜法是最通用的檢測(cè)方法。精制馬拉硫磷溶液作為獸用制劑收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017年版，化學(xué)藥品卷)中[8]，其含量測(cè)定為填充柱氣相色譜法，采用該法測(cè)定精制馬拉硫磷溶液含量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性均較差，給檢驗(yàn)工作帶來了諸多麻煩。為了更好地控制精制馬拉硫磷溶液質(zhì)量，本研究建立毛細(xì)管柱氣相色譜法測(cè)定精制馬拉硫磷溶液含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 氣相色譜儀(Agilent 6890N，火焰離子化檢測(cè)器FID，美國(guó) Agilent公司，配B04.01C 化學(xué)工作站)；電子天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO 公司，精度為0.01 mg)；馬拉硫磷對(duì)照品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)H0671311，含量為99.0%)；鄰苯二甲酸二丙酯內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(北京曼哈格生物科技有限公司，批號(hào)B0002771，含量為99.5%)；精制馬拉硫磷溶液(來源：企業(yè)1，規(guī)格：70%，批號(hào)：2019042801、2019042802、2019042803；規(guī)格：45%，批號(hào)：2019042701、2019042702、2019042703；企業(yè)2，規(guī)格：20%，批號(hào)20171201、20171202、20171203)；精制馬拉硫磷原料(企業(yè)1提供，含量為96.5%)；空白輔料(乳化劑0202-C，乳化劑DZ-0248，乳化劑150，企業(yè)1和企業(yè)2提供)；丙酮(色譜級(jí)，德國(guó)默克公司，批號(hào)1404012802)。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜條件 色譜柱：Agilent HP-5毛細(xì)管柱(固定相：5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，規(guī)格：30 m×0.320 mm×0.25 μm)；柱溫：230 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測(cè)器溫度(FID)：265 ℃；載氣：氮?dú)?；流速? mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL(分流比50 ∶1)。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取鄰苯二甲酸二丙酯適量，加丙酮溶解并稀釋成每1 mL中含20 mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取馬拉硫磷對(duì)照品約0.22 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.2.2.1項(xiàng)的內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，密塞，振搖使溶解，作為對(duì)照品溶液。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 分別取規(guī)格為20%供試品約1.10 g，規(guī)格為45%供試品約0.49 g，規(guī)格為70%供試品約0.31 g(約相當(dāng)于精制馬拉硫磷0.22 g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.2.2.1項(xiàng)的內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，密塞并振搖使溶解，分別作為規(guī)格為20%、45%和70%的供試品溶液。

1.2.2.4 線性溶液的制備 取馬拉硫磷對(duì)照品適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.2.2.1項(xiàng)的內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，分別配制濃度為35.2、39.6、44.0、48.4、52.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)線性系列溶液。

1.2.2.5 回收率供試品溶液的制備 取空白輔料乳化劑DZ-0248、乳化劑150和精制馬拉硫磷原料，按處方比例分別制備成規(guī)格為20%和45%精制馬拉硫磷溶液各6份；取空白輔料乳化劑0202-C和精制馬拉硫磷原料制備成規(guī)格為70%精制馬拉硫磷溶液6份；取上述制備的供試品適量，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入1.2.2.1項(xiàng)的內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，密塞并振搖使溶解，分別作為回收率供試品溶液。

1.2.3 供試品測(cè)定 分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)的色譜條件操作，分別注入氣相色譜儀，得對(duì)照品和供試品溶液中馬拉硫磷和鄰苯二甲酸二丙酯的峰面積，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算供試品中馬拉硫磷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜系統(tǒng)適用性考察 分別取對(duì)照品溶液及20%、45%和70%的供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)的氣相色譜條件操作，分別對(duì)馬拉硫磷主峰的保留時(shí)間、馬拉硫磷主峰和鄰苯二甲酸二丙酯主峰的分離度、馬拉硫磷主峰的理論板數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果見表1和圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液中馬拉硫磷主峰保留時(shí)間約為4.5 min，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.07%～0.18%之間；馬拉硫磷主峰和鄰苯二甲酸二丙酯主峰的分離度均大于10，RSD均在0.18%～0.27%之間；馬拉硫磷主峰的理論板數(shù)均大于20000，RSD在0.30%～0.46%之間，具有較好的色譜系統(tǒng)適用性。

表1 氣相色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)考察結(jié)果(n=6)Tab 1 Results of the chromatographic system suitability(n=6)

圖1 對(duì)照品溶液和供試品溶液氣相色譜圖Fig 1 The chromatogram of the standard solution and the sample solution

2.2 線性關(guān)系考察 分別取1.2.2.4項(xiàng)中標(biāo)準(zhǔn)線性系列溶液1 μL，注入氣相色譜儀，按1.2.1項(xiàng)的氣相色譜條件操作，計(jì)算馬拉硫磷峰面積與鄰苯二甲酸二丙酯(內(nèi)標(biāo))峰面積的比值，以馬拉硫磷濃度(x)為橫坐標(biāo)，馬拉硫磷峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在馬拉硫磷濃度在35.2～52.8 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3 回收率試驗(yàn) 分別取1.2.2.5項(xiàng)中回收率供試品溶液，按1.2.3項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算測(cè)定結(jié)果，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的20%精制馬拉硫磷溶液的平均回收率為99.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.2%，RSD為0.2%；制備的45%精制馬拉硫磷溶液的平均回收率為99.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.3%，RSD為0.3%；制備的70%精制馬拉硫磷溶液的平均回收率為98.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.3%，RSD為0.3%，方法的準(zhǔn)確度較好。

表2 馬拉硫磷的線性關(guān)系Tab 2 Linear relationship of malathion

表3 回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Tab 3 Method recovery test results

2.4 精密度試驗(yàn)

2.4.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取馬拉硫磷對(duì)照品溶液1份，重復(fù)進(jìn)樣6次，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算校正因子，檢驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)定的重復(fù)性；取供試品一批，分別制備成供試品溶液6份進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算馬拉硫磷和鄰苯二甲酸二丙酯峰面積比值，檢驗(yàn)供試品測(cè)定的重復(fù)性，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，校正因子的RSD為0.47%；6份供試品峰面積比值的RSD為1.07%，系統(tǒng)和供試品測(cè)定重復(fù)性均良好。

2.4.2 中間精密度實(shí)驗(yàn) 分別取規(guī)格為20%、45%和70%的供試品各一批，分別于不同日期和不同人員，對(duì)上述供試品的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同日期和不同人員對(duì)規(guī)格為20%馬拉硫磷含量測(cè)定結(jié)果的RSD為0.20%、規(guī)格為45%的RSD為0.10%、規(guī)格為70%的RSD為0.10%，精密度均較好。

表4 方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Repeatability test results of the method

表5 方法的中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Intermediate precision test results of the method

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取規(guī)格為20%、45%和70%的供試品溶液各一批，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、16、24 h后采集色譜圖，考察馬拉硫磷和鄰苯二甲酸二丙酯峰面積的變化情況，在0～10 h，規(guī)格為20%、45%和70%的供試品溶液測(cè)得馬拉硫磷和鄰苯二甲酸二丙酯峰面積的RSD均小于1.5%；在16 h后峰面積均存在一定程度的下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 供試品含量測(cè)定 分別取企業(yè)1規(guī)格為45%和70%的供試品及企業(yè)2規(guī)格為20%的供試品各3批，進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)規(guī)格9批次供試品含量的平均標(biāo)示量的RSD均小于0.5%。

表6 供試品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab 6 Results of sample determination(n=3)

3 討論與結(jié)論

3.1 方法的選擇 目前，從精制馬拉硫磷含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道來看，精制馬拉硫磷原料可采用HPLC法測(cè)定[11-12]，結(jié)果相對(duì)可靠；精制馬拉硫磷溶液含量測(cè)定有HPLC法[13]和GC法[5,7-8]，其中GC法含量測(cè)定均為填充柱氣相色譜法，采用該法測(cè)定精制馬拉硫磷溶液含量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性均較差；本實(shí)驗(yàn)也參考了文獻(xiàn)報(bào)道方法[11-13]對(duì)精制馬拉硫磷溶液(規(guī)格20%、45%和70%)含量測(cè)定進(jìn)行了優(yōu)化研究，結(jié)果表明，對(duì)規(guī)格為20%和45%的精制馬拉硫磷溶液，由于其輔料組成較規(guī)格為70%的要復(fù)雜，馬拉硫磷主峰與雜質(zhì)峰很難通過優(yōu)化方法來進(jìn)行分離，導(dǎo)致含量測(cè)定結(jié)果的不準(zhǔn)確，故HPLC法不適用于規(guī)格為20%和45%精制馬拉硫磷溶液含量的測(cè)定。采用建立的毛細(xì)管柱氣相色譜法就較好的解決了上述難題，大大縮短了分析時(shí)間，且結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。

3.2 檢測(cè)器的選擇 目前氣相色譜用于馬拉硫磷含量測(cè)定的檢測(cè)器主要有火焰離子化檢測(cè)器(FID)[5,7-8]、火焰光度檢測(cè)器(FPD)[9]、氮磷檢測(cè)器(NPD)[10]，其中FPD和NPD適用于樣品中痕量或微量馬拉硫磷的測(cè)定，精制馬拉硫磷溶液的含量測(cè)定為常量分析，F(xiàn)ID作為高靈敏度通用性檢測(cè)器，適用于常量馬拉硫磷含量測(cè)定，響應(yīng)快，峰形好，色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果滿意，故選擇FID是適宜的。

3.3 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇 在收載的標(biāo)準(zhǔn)中采用丙體六六六作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)[8]，其不易獲得，且其毒性較大，長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)對(duì)檢測(cè)人員及環(huán)境造成危害，在研究過程中選擇了毒性相對(duì)較弱的鄰苯二甲酸二丙酯作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，其色譜峰的位置與馬拉硫磷主峰的位置相近，且與精制馬拉硫磷溶液中各組分的色譜峰均能完全分離。

3.4 柱溫的選擇 色譜柱溫在150～250 ℃范圍內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，柱溫為230 ℃的恒溫條件下，馬拉硫磷主峰、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰、溶劑峰、雜質(zhì)峰的分離效果均較好且保留時(shí)間的重復(fù)性也較好，縮短了分析時(shí)間。

采用毛細(xì)管柱氣相色譜法測(cè)定精制馬拉硫磷溶液含量，該方法操作簡(jiǎn)便易行，專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，適用于精制馬拉硫磷溶液含量測(cè)定的質(zhì)量控制。