李文輝,孫志文

(北京市獸藥監(jiān)察所, 北京 102600)

磺胺類藥物為人工合成的抗菌藥，它具有抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定、使用簡便、生產(chǎn)時不耗用糧食等優(yōu)點。特別是1969年抗菌增效劑-甲氧芐啶(TMP)發(fā)現(xiàn)以后，與磺胺類藥物聯(lián)合應(yīng)用可使其抗菌作用增強、治療范圍擴大，對革蘭陽性及陰性菌均有抑制作用。抗菌機制是通過與對氨基苯甲酸競爭細(xì)菌的二氫葉酸合成酶, 導(dǎo)致細(xì)菌體內(nèi)葉酸合成受阻而使細(xì)菌的生長、繁殖受挫?；前奉愃幬锓N類多，本文主要研究獸醫(yī)領(lǐng)域經(jīng)常使用的磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑。甲氧芐啶是抗菌增效劑的一種, 屬于二氨基嘧啶類藥物, 它干擾細(xì)菌的葉酸代謝, 阻止細(xì)菌菌體蛋白合成中的二氫葉酸還原成四氫葉酸, 進而影響菌體合成去氧核酸、核搪核酸、菌體蛋白等, 使細(xì)菌生長和繁殖不能正常進行[1]。與此同時, 磺胺類藥物利用其結(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸相似, 可以競爭二氫葉酸合成酶, 抑制二氫葉酸的合成。所以經(jīng)常將磺胺類與甲氧芐啶合用, 達到抗菌增效的效果。2000年, 大腸桿菌對甲氧芐啶的耐藥率在一些研究中達到70%以上, 表明食品動物細(xì)菌耐藥性的增長與獸醫(yī)臨床抗菌藥的持續(xù)和大劑量的使用有關(guān)[2]; 甲氧芐啶可以引起骨髓微核抑制和其他的不良反應(yīng)[3], 2類藥物若在動物源性食品中殘留, 人類在食用后就可能在人體內(nèi)形成蓄積, 對身體造成很大的危害。為了控制磺胺類藥物和甲氧芐啶的使用，中國、歐盟等國家和組織對它們的最高殘留限量做出了規(guī)定, 我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年頒布的GB31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》[4]， 對磺胺類藥物的規(guī)定是所有食品動物中脂肪的最大殘留限量100 μg/kg; 對甲氧芐啶的規(guī)定是禽的肌肉、皮脂、肝臟、腎臟中的最大殘留限量50 μg/kg， 并且規(guī)定日允許量為0～4.2 μg/kg·BW/d。目前磺胺類藥物的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[5]、液相色譜法[6-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-14]，甲氧芐啶的檢測方法主要是液相色譜法[15]，單獨檢測磺胺類藥物或者甲氧芐啶的方法比較多， 同時進行動物源性2類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法較少，并且靈敏度不夠高[16]，尤其是雞蛋組織中2類藥物同時檢測的方法鮮有報道，而且這些方法具有前處理步驟多、效率低、檢測組織等局限。

現(xiàn)今食品安全問題已經(jīng)成為與人們生活密切相關(guān)的問題, 動物性食品中抗生素等有毒有害物質(zhì)一旦超過限量, 將嚴(yán)重威脅人類的身體健康。本研究建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)同時測定雞蛋中5種磺胺類藥物和甲氧芐啶的檢測方法, 以期方便日常檢測工作。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters Xevo TQ-XS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)； PB602-N電子天平(瑞士Mettler公司)；氮吹儀(美國Organomation Associates公司)； CF16RN高速冷凍離心機(日本HITACHI 公司)； MS 3 basic渦旋混合器水平振蕩器(德國IKA 公司)；Milli-Q academic超純水儀(美國Millipore 公司)；溶劑過濾器(美國PALL公司)； 微量加樣器(德國Eppendorf 公司)。

1.2 試劑和耗材 磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑5種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.1%)、甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品(99.2%)(德國Dr.Ehrenstorfer公司); 甲醇、乙腈、甲酸(質(zhì)譜純,美國Thermo Fisher Scientific公司); 正己烷(分析純, 北京化工試劑廠)；所用水為超純水；Sep-Pak Vac 12cc(2g) Alumina B Cartridges(美國沃特世公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別精密稱取5種磺胺類藥物、甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg, 于10 mL容量瓶中, 用乙腈溶解并定容至刻度, 配制成1 mg/mL磺胺類藥物、甲氧芐啶的標(biāo)準(zhǔn)儲備液; 準(zhǔn)確吸取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液至另一10 mL容量瓶中, 用乙腈+0.1%甲酸水溶液(20 ∶80,V∶V)溶解并稀釋至刻度, 配制成10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品采集與制備 試驗所采用的樣品， 來自標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)殖示范基地，經(jīng)檢測無藥物殘留，將雞蛋均質(zhì)勻漿，置于50 mL離心管中備用。

1.5 樣品的前處理 稱取雞蛋試樣(5±0.02) g, 置于50 mL塑料離心管, 加乙腈20 mL, 50 ℃水浴5 min, 渦旋混勻, 渦旋振蕩10 min, 8000 r/min離心10 min, 取上層液體于另一離心管中; 10 mL乙腈重復(fù)提取一次, 合并上清液, 于50 ℃水浴氮氣吹干。

在殘留物加入95%乙腈5 mL溶解，直接過Sep-Pak Vac 12cc(2g) Alumina B Cartridges堿性氧化鋁柱，吹干，再用5 mL 30%乙腈洗脫，收集洗脫液，用0.22 μm濾膜過濾, 濾液供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件 色譜柱為美國沃特世Waters ACQUITY UPLC(BEH C18 1.7 μm，2.1 x 50 mm); 流動相A相為乙腈溶液, B相為0.1%甲酸水溶液; 流速: 0.25 mL/min; 進樣量: 5 μL; 柱溫30 ℃。色譜梯度洗脫條件見表1。

1.6.2 質(zhì)譜條件 離子源: 電噴霧離子源; 掃描方式: 正離子掃描; 檢測方式: 多反應(yīng)監(jiān)測(multiple response monitoring, MRM); 電離電壓: 2.0 kV; 源溫: 150 ℃; 霧化溫度: 450 ℃; 錐孔氣流速: 150 L/h; 霧化氣流速: 650 L/h(表2)。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution conditions of liquid chromatography

表2 5種磺胺類藥物和甲氧芐啶定性、 定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair, cone hole voltage and collision energy of five kinds of sulfonamide and trimethoprim

1.7 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 在空白雞蛋基質(zhì)中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成6個不同濃度(0.5、2.5、5.0、20、50、100 μg/kg)系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液, 以其濃度為橫坐標(biāo), 對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 方法的回收率、精密度和靈敏度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法, 分別準(zhǔn)確稱取空白樣品2 g, 添加一定體積的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液, 使雞蛋中5種磺胺類藥物、甲氧芐啶濃度分別為1.0、25、50、100 μg/kg, 按上述樣品前處理方法處理后進行測定, 一日內(nèi)每種藥物的每個添加濃度取5個平行樣品分別進行測定, 每個添加濃度設(shè)5個平行, 重復(fù)測定3 d, 外標(biāo)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，計算回收率和批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

采用空白雞蛋中添加目標(biāo)化合物的方法, 依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法定量限,S/N≥10的濃度為方法定量限, 添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 g空白試樣中,制備得到一定濃度的添加樣品, 經(jīng)前處理后檢測, 在相應(yīng)的保留時間, 空白試樣對所測藥物無干擾, 測定靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性結(jié)果 以6個不同濃度系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo), 對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線, 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可見，在0.5～100 μg/kg的濃度范圍內(nèi)5種磺胺類藥物、甲氧芐啶色譜峰面積與濃度呈良好線性相關(guān), 相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab 3 Linear regression equations and Correlation Coefficients

2.2 回收率、精密度和靈敏度 根據(jù)回收率的測定方法進行測定, 結(jié)果表明, 雞蛋樣品中5種磺胺類藥物、甲氧芐啶在1.0～100 μg/kg添加水平內(nèi)的平均回收率為66.3%～97.5%, 批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～9.7%, 批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4%～11.4%。結(jié)果表明5種磺胺類藥物、甲氧芐啶的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足殘留檢測的相關(guān)要求, 且方法的重現(xiàn)性很好。雞蛋中5種磺胺類藥物和甲氧芐啶添加回收率實驗結(jié)果見表4。取信噪比S/N≥3時的濃度為檢測限，信噪比S/N≥10的濃度為定量限,測得該方法檢測限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。其中50 μg/kg 5種磺胺類藥物和甲氧芐啶基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖如圖1, 5種磺胺類藥物和甲氧芐啶雞蛋空白MRM色譜圖如圖2, 雞蛋添加50 μg/kg 5種磺胺類藥物和甲氧芐啶MRM色譜圖如圖3。

表4 5種磺胺類藥物和甲氧芐啶的添加回收率試驗結(jié)果Tab 4 Results of tests on the recoveries of five kinds of sulfonamide and Trimethoprim

圖1 50 ng/mL 5種磺胺類藥物和甲氧芐啶基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖 (1.磺胺甲惡唑；2.磺胺二甲嘧啶；3.磺胺間甲氧嘧啶；4.甲氧芐啶；5.磺胺喹噁啉；6.磺胺二甲氧嘧啶)Fig 1 MRM chromatogram of 50 ng/mL five kinds of sulfonamide and trimethoprim matrix matching standard solution ( 1.sulfamethoxazole；2.salfamethazine；3.sulfamonimethoxine；4.trimethoprim；5.sulfaquinoxaline；6.sulfadoxine)

圖2 5種磺胺類藥物和甲氧芐啶雞蛋空白MRM色譜圖 (1.磺胺甲惡唑2.磺胺二甲嘧啶3.磺胺間甲氧嘧啶4.甲氧芐啶5.磺胺喹噁啉6.磺胺二甲氧嘧啶)Fig 2 Blank MRM chromatogram of five kinds of sulfonamide and trimethoprim in eggs ( 1.sulfamethoxazole；2.salfamethazine；3.sulfamonimethoxine；4.trimethoprim；5.sulfaquinoxaline；6.sulfadoxine)

圖3 雞蛋添加50 μg/kg 5種磺胺類藥物和甲氧芐啶MRM色譜圖 (1.磺胺甲惡唑2.磺胺二甲嘧啶3.磺胺間甲氧嘧啶4.甲氧芐啶5.磺胺喹噁啉6.磺胺二甲氧嘧啶)Fig 3 MRM chromatogram of eggs added with 50 μg/kg five kinds of sulfonamide and trimethoprim ( 1.sulfamethoxazole；2.salfamethazine；3.sulfamonimethoxine；4.trimethoprim；5.sulfaquinoxaline；6.sulfadoxine)

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的確定 色譜柱的選擇：選擇常用的Agilent ZORBAXSB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm) 和Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm) 進行分離實驗對比分析結(jié)果顯示，使用BEH C18進行分離時，各化合物的峰形較好，信噪比更高，主要是因為BEH C18是端基封尾的色譜柱，其固定相上無殘留的硅羥基，可以改善峰的形狀，且耐受的pH更寬，因此，最終選擇BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm) 作為分離柱。

流動相的選擇：本方法對比了甲醇和乙腈作為有機相時的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈可提高待測組分的離子化效率，而在水相中加入0.1%甲酸時，化合物的離子化效果更好，峰形有所改善，靈敏度也相應(yīng)提高。

確定以乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動相，目標(biāo)化合物可獲得較好的分離度，且保留時間適中，靈敏度高。

3.2 質(zhì)譜條件的確定 使用液質(zhì)聯(lián)用方法進行檢測時，質(zhì)譜條件可直接影響方法的靈敏度，優(yōu)化條件主要包括一級質(zhì)譜掃描(Q1掃描)、二級質(zhì)譜掃描(子離子掃描)和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描，其中一級質(zhì)譜條件主要需優(yōu)化的參數(shù)為錐孔電壓，其他參數(shù)如毛細(xì)管電壓、萃取錐孔電壓等的變化對待測化合物離子響應(yīng)變化影響不大；二級質(zhì)譜條件主要優(yōu)化碰撞能量。本實驗采用注射桿直接進樣的方式，分別進1 μg/mL的5種磺胺和甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)溶液來優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。結(jié)合分子式結(jié)構(gòu)并比較電噴霧正負(fù)離子模式下的信號強度，最終本實驗選擇電噴霧正離子模式。在Q1掃描中找出每個化合物的母離子，在子離子掃描中找到3～4個響應(yīng)較大的子離子，最后在MRM掃描下優(yōu)化參數(shù)，選擇響應(yīng)較高,穩(wěn)定性好的1個子離子作為定量離子,優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

3.3 前處理方法的優(yōu)化 對動物性產(chǎn)品常用的前處理提取試劑為乙腈[16]、甲酸乙腈[14]乙酸乙酯[10]、丙酮[10]提取試劑,本方法嘗試以上試劑發(fā)現(xiàn)，使用乙腈作為提取試劑獲得的回收率和峰型最好，進行兩次提取比進行一次提取后溶液更干凈，更容易進一步實驗，采用正己烷除脂肪是效果比較好的試劑，但進行兩次除脂肪比較麻煩[17]，本研究選用堿性氧化鋁柱能除脂和雜質(zhì)，過柱速度非?？?，一般只需要1～2 min就可以完成，跟不過柱直接上機相比，更容易過膜且峰型明顯偏好，同時進行了HLB、MCX、MAX萃取柱過柱回收率的比較，發(fā)現(xiàn)回收率明顯偏低，而且過柱時間長。

本研究采用乙腈提取堿性氧化鋁柱凈化的前處理技術(shù), 建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測雞蛋中5種磺胺類藥物、甲氧芐啶殘留量的方法。該方法在0.5～100 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi), 線性關(guān)系良好, 相關(guān)系數(shù)均大于0.99。在1.0～200 μg/kg添加水平, 平均回收率在66.3%～97.5%之間, 回收率高, 方法檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。該方法具有準(zhǔn)確度高、精密度好、前處理簡單快捷、成本低廉等特點, 適用于雞蛋中5種磺胺類藥物、甲氧芐啶殘留量的檢測。