王林，高曉龍，吳迪，張瑋，張啟龍，栗云鵬，程汝佳，杜鵑，李蕊，王培， 馮小宇，韋海濤，周德剛，劉曉冬，宋彥軍

(北京市動物疫病預防控制中心，北京102629)

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染家豬和野豬引起的一種高度接觸性的烈性傳染病，致死率幾乎100%，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告?zhèn)魅静　Ｗ?921年肯尼亞首次發(fā)生非洲豬瘟疫情以來，該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重威脅和巨大經(jīng)濟損失。上世紀中葉非洲豬瘟通過航空運輸傳入歐洲，相繼在意大利、葡萄牙、法國、比利時、荷蘭等國家暴發(fā)疫情，經(jīng)過二三十年的努力，除意大利撒丁島外，歐洲其他國家成功將該病根除；但2007年，格魯吉亞暴發(fā)非洲豬瘟疫情后，該病持續(xù)向全球蔓延，在俄羅斯、白俄羅斯、波蘭等東歐國家和地區(qū)廣泛流行[1]。我國自2018年10月發(fā)生首例非洲豬瘟疫情以來[2]，迅速蔓延全國31個省份，截至2019年10月全國共報告158起非洲豬瘟疫情，共撲殺生豬百萬余頭，導致我國生豬養(yǎng)殖遭受毀滅性打擊，甚至給我國經(jīng)濟、政治、社會帶來嚴重的影響。鑒于當前無有效商品化疫苗可用[3]，因此非洲豬瘟的早期快速準確診斷對該病的防控具有非常重要的意義。

國內(nèi)外研究人員針對非洲豬瘟病毒建立了多種核酸檢測方法[4]，主要有PCR、熒光定量PCR、數(shù)字PCR[5]、恒溫RPA-LFD[6]以及納米孔測序[7]等，但這些方法存在檢測時間長、操作繁瑣、設備要求高、成本高、易污染等問題。雖然恒溫RPA-LFD檢測方法反應時間僅為20 min，但其利用免疫層析試紙條進行結果判讀仍需10～15min，操作繁瑣同樣不利于非洲豬瘟的現(xiàn)場快速診斷，而環(huán)介導等溫快速檢測方法(Loopmediated Isothermal Amplification, LAMP)具有特異性好、靈敏度高、操作方便等優(yōu)點[8-9]，且多位研究人員也針對口蹄疫[10]、禽流感[11]、圓環(huán)3型[12]、中東呼吸綜合征病毒[13]以及西尼羅河病毒[14]等多種疾病建立了LAMP恒溫快速檢測方法。

因此，本研究基于LAMP擴增技術針對ASFV p72基因保守區(qū)域設計特異性引物組建立ASFV恒溫快速檢測方法，并通過向LAMP反應體系中添加SYTO9熒光染料實現(xiàn)對擴增反應的實時監(jiān)控和結果判定，同時對該方法的靈敏度、特異性、重復性、符合率和適用儀器等進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和試劑 便攜式MA-1610型等溫熒光PCR儀(購自北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司)、ABI QuantStudio 7熒光定量PCR儀、LoopampDNA 擴增試劑盒(購自榮研生物科技(中國)有限公司)、SYTO9(購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、DNA核酸提取試劑盒(購自杭州博日科技有限公司)

1.1.2 毒株與樣品 非洲豬瘟病毒p72基因保守區(qū)域DNA質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

非洲豬瘟陽性樣本核酸、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV-JXA1株)、歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV-LV株)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)Genbank已發(fā)表的ASFV Georgia株(GenBank: MH910495.1)，運用“環(huán)介導等溫擴增法引物設計輔助軟件(http:∥primerexplorer.jp/)在線設計非洲豬瘟病毒p72基因的內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物，引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 引物篩選 將人工合成的ASFV p72基因保守區(qū)域DNA質(zhì)粒稀釋成濃度為1×104copies/μL和無RNase水作為陽性模板和陰性模板，63℃擴增120 min，根據(jù)陽性反應時間、“S型”擴增曲線和非特異性曲線等結果綜合分析，篩選ASFV實時熒光LAMP快速檢測方法的最佳引物組。

表1 基于ASFV p72基因設計的LAMP擴增引物Tab 1 LAMP Primers designed for the P72 gene of ASFV

1.2.3 方法的建立與優(yōu)化 按照LoopampDNA 擴增試劑盒說明書進行配制ASFV熒光LAMP基礎反應體系18.5 μL，包含2×LAMP反應液 12.5 μL，外引物(F3/B3，濃度為5 μM)各1μL、內(nèi)引物(FIP/BIP，濃度為40 μM)各1μL、環(huán)引物LB(濃度為20 μM)1 μL、Bst DNA 聚合酶1 μL，SYTO9熒光染料(1 mM)1 μL，DNA模板2 μL，無DNA酶水補足至25 μL。反應條件為63℃，1 min，50cycles。

以濃度為1×105copies/μL 的DNA質(zhì)粒為模板，分別在61℃、63℃、65℃、67℃ 等4個溫度條件下進行擴增，根據(jù)陽性反應時間確定最佳反應溫度。

分別以濃度為1×106～1×101copies/μL 的p72基因質(zhì)粒為模板，在最佳反應溫度時進行擴增，根據(jù)最低檢測限來確定最佳反應時間。

1.2.4 靈敏度驗證 將濃度為1×106copies/μL 的p72基因質(zhì)粒進行10倍系列稀釋，稀釋至1×100copies/μL同時進行實時熒光LAMP檢測，每個濃度做3個重復，驗證該方法靈敏性。

1.2.5 特異性驗證 將本實驗室保存的ASFV核酸(經(jīng)實驗室檢測不含PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、FMDV、PCV2和PCV3等病毒核酸)和PRV、CSFV、PRRSV-JXA1株、PRRSV-LV株、PEDV提取核酸后進行實時熒光LAMP檢測，驗證該方法的特異性。

1.2.6 重復性驗證 分別以濃度為1×105～1×101copies/μL的p72基因質(zhì)粒為模板，進行實時熒光LAMP擴增，每個稀釋度重復4次，根據(jù)其Ct值計算變異系數(shù)，評價該方法的重復性。

1.2.7 儀器適用性驗證 使用濃度為1×106～1×101copies/μL的p72基因質(zhì)粒為模板，分別在ABI QuantStudio 7熒光定量PCR儀和便攜式MA-1610型等溫熒光PCR儀進行實時熒光LAMP擴增，對本方法適用儀器進行驗證。

1.2.8 臨床樣本檢測 分別采用本研究建立的ASFV實時熒光LAMP快速檢測方法和《非洲豬瘟病毒檢測操作規(guī)程(試行)》“非洲豬瘟核酸檢測技術(方法一)”規(guī)定的實時熒光PCR檢測方法，對本實驗室采集的20份飼料、30份血液、20份脾臟等70份樣品進行檢測，分析該方法的符合率。

2 結果與分析

2.1 引物篩選 分別使用設計的ASFV-LAMP擴增引物組A和B對1×105copies/μL DNA合成質(zhì)粒和陰性對照63℃擴增2h。結果(圖1)顯示，A組引物在29 min出現(xiàn)明顯的“S”型擴增曲線且陰性對照無非特異性擴增，而B組引物在75 min才檢出陽性DNA模板，A組引物陽性檢出時間優(yōu)于B組，因此選擇A組引物為ASFV實時熒光LAMP檢測引物。

圖1 ASFV實時熒光 LAMP引物篩選Fig 1 Primers screening of real-time fluorescent LAMP for ASFV

2.2 方法的建立與優(yōu)化 經(jīng)優(yōu)化后的ASFV實時熒光LAMP快速檢測方法反應體系為25 μL，分別為2×LAMP反應液 12.5 μL，外引物(F3/B3，濃度為5 μM)各1 μL、內(nèi)引物(FIP/BIP，濃度為40 μM)各1 μL、環(huán)引物LB(濃度為20 μM)1 μL、Bst DNA 聚合酶1 μL，SYTO9熒光染料(1mM)1 μL，DNA模板2 μL，無DNA酶水3.5 μL。

最佳反應溫度優(yōu)化結果(圖2)顯示，61℃時Ct值為21.89，63℃時Ct值為19.57，65℃時Ct值為21.06，67℃時Ct值為25.75，表明同一模板濃度條件下，63℃擴增時間最短，因此最佳反應溫度為63℃。

圖2 反應溫度優(yōu)化Fig 2 Optimization of reaction temperature

2.3 靈敏度及最佳反應時間 以1×106～1×100copies/μL 的p72基因質(zhì)粒為模板進行實時熒光LAMP擴增。結果(圖3)顯示，ASFV實時熒光LAMP檢測方法最低檢測限為10 copies/μL。ASFV實時熒光LAMP標準曲線(圖4)表明該檢測方法結果Ct值與模板濃度呈線性相關，R2為0.992，表明線性關系良好。

由圖3可知，本方法最低檢測限為10 copies/μL，重復3次的平均Ct值為30.21，因此本方法最佳反應循環(huán)數(shù)為40 cycles，即最佳反應時間為40 min。

1～7: 1×106 ～1×100 copies/μL圖3 ASFV實時熒光LAMP靈敏度驗證Fig 3 Sensitivity of ASFV real-time fluorescent LAMP

圖4 ASFV實時熒光 LAMP標準曲線Fig 4 Standard curve of ASFV real-time fluorescent LAMP

2.4 特異性驗證 采用ASFV、PRV、CSFV、PRRSV-JXA1株、PRRSV-LV株、PEDV進行實時熒光LAMP擴增，驗證其特異性。結果(圖5)顯示，除ASFV出現(xiàn)特異性擴增外，其余病毒檢測均為陰性，表明該方法特異性良好。

2.5 重復性驗證 采用1×105～1×101copies/μL的p72基因質(zhì)粒為模板進行實時熒光LAMP擴增，每個稀釋度重復4次，結果如表2所示，變異系數(shù)均小于5%，說明該方法重復性良好。

2.6 適用儀器驗證 利用ASFV實時熒光LAMP方法分別在ABI QuantStudio 7熒光定量PCR儀和便攜式MA-1610型等溫熒光PCR儀上對1×106～1×101copies/μL濃度的質(zhì)粒模板進行擴增，結果(圖6)顯示，全部濃度的質(zhì)粒均能檢出，表明本方法儀器適用性好，既可適用于獸醫(yī)診斷實驗室常用的熒光定量PCR儀，也能適用于便攜式恒溫熒光PCR儀。

圖5 ASFV實時熒光LAMP特異性驗證Fig 5 Specificity of ASFV real-time fluorescent LAMP

表2 ASFV實時熒光LAMP重復性驗證Tab 2 Repeatability of ASFV real-time fluorescent LAMP

A：便攜式MA-1610型等溫熒光PCR儀；B：ABI QuantStudio 7熒光定量PCR儀； 1～6：1×106 ～1×101 copies/μL；7：陰性對照 A: Portable isothermal fluorescence PCR(MA-1610)； B: ABI QuantStudio 7； 1～6：1×106 ～1×101 copies/μL；7: Negative control圖6 ASFV實時熒光LAMP方法不同儀器適用性驗證Fig 6 Verification for the applicability of ASFV real- time fluorescent LAMP in different PCR instruments

2.7 臨床樣品檢測 采用本研究建立的ASFV實時熒光LAMP方法和標準方法qPCR同時對70份臨床樣品進行ASFV檢測。結果(表3)顯示，LAMP方法檢測出4份血液樣品、9份脾臟樣品檢測陽性，其余樣品均為陰性，與標準方法qPCR檢測結果一致，符合率為100%。

表3 實時熒光LAMP和qPCR臨床樣品檢測結果Tab 3 Parallel test results between real-time fluorescent LAMP and qPCR for clinical samples

3 討論與結論

自2018年10月我國暴發(fā)首例非洲豬瘟疫情以來，迅速蔓延至全國，給我國生豬養(yǎng)殖造成非常嚴重的損失。因此非洲豬瘟的現(xiàn)場快速診斷對于該病的發(fā)現(xiàn)、傳播和控制具有重要的意義。LAMP恒溫快速檢測技術能夠針對保守區(qū)域設計4-6對引物，在60～65 ℃恒溫條件下40～60 min即可完成檢測，具有方便、快捷、準確等優(yōu)點，廣泛用于細菌、寄生蟲、病毒的現(xiàn)場快速檢測。目前LAMP檢測結果的判定主要有濁度法、鈣黃綠素目視法、瓊脂糖凝膠電泳法以及免疫層析法等，但濁度法對儀器設備要求高、鈣黃綠素目視法對弱陽樣品存在人為誤判且成本高、瓊脂糖凝膠電泳和免疫層析反應管開蓋極易造成環(huán)境污染，造成LAMP檢測技術難以在臨床應用推廣。Than Linh Quyen等研究發(fā)現(xiàn)SYTO9作為一種激發(fā)波長和發(fā)射波長與FAM相近的DNA熒光染料(激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為498 nm)，其具有信噪比高、靈敏度高、對擴增反應無抑制作用等優(yōu)點，可用于LAMP擴增反應過程中的實時監(jiān)控，有助于提高LAMP檢測的準確性以及減少氣溶膠污染[15]。

因此，本研究針對非洲豬瘟病毒P72基因保守區(qū)域設計特異性LAMP檢測引物，包括2條內(nèi)引物、2條外引物和1條環(huán)引物，并對反應溫度、時間等反應條件進行優(yōu)化，同時通過在反應體系中添加適量的SYTO9熒光染料，建立了非洲豬瘟病毒SYTO9實時熒光LAMP快速檢測方法。本方法反應時間短，在63 ℃恒溫條件下反應40 min即可完成擴增反應，最快15～20min就能檢測到ASFV；靈敏度高，最低檢測限為10 copies/μL；特異性良好，PRV、CSFV、PRRSV、PEDV等病毒不發(fā)生非特異性擴增；重復性好，變異系數(shù)均小于5%，；符合率高，與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的熒光定量PCR方法符合率為100%;適用儀器較廣，不僅適用于等溫熒光PCR儀，同時也適用于各種常規(guī)熒光定量PCR儀器。

綜上所述，本研究建立的基于SYTO9熒光染料的非洲豬瘟病毒實時熒光LAMP快速檢測方法具有反應快速(40 min)、靈敏度高、特異性強、重復性好、符合率高、操作簡便、不易污染、適用儀器廣等優(yōu)勢，可用于非洲豬瘟現(xiàn)場快速鑒別診斷，為非洲豬瘟現(xiàn)場應急檢測和防控提供了一種新方法，更適合基層推廣應用。