朱慶賀，苗艷，楊旭東，王爽，張鵬宇，陳曦，王觀悅，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005)

4型禽腺病毒是指禽腺病毒1亞群血清4型，能夠引起雞心包積水。該病的特征性癥狀為心包出現(xiàn)淡黃色透明液體，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)如肝臟腫脹、腎臟水腫、尿酸鹽沉積等臨床癥狀，因此臨床中稱為雞心包積水綜合征。該病最早在巴基斯坦的安卡拉首先被報(bào)道，因此又稱安卡拉病，其后在斯洛伐克、印度、墨西哥、秘魯、俄羅斯、孟加拉國(guó)、韓國(guó)相繼出現(xiàn)[1]。2006年該病第一次在中國(guó)被報(bào)道[2]，2015年7月開(kāi)始在我國(guó)的河南、河北、新疆、安徽、山東、江西、湖北和江蘇等省份迅速傳播[3-4]。該病主要發(fā)生在炎熱濕潤(rùn)的夏季，但其他季節(jié)也可零星發(fā)生，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)40%～90%[5]。自2016年以來(lái)黑龍江省部分地區(qū)出現(xiàn)流行[6]，給該省養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。鑒于當(dāng)前4型禽腺病毒的嚴(yán)重情況，迫切需要研發(fā)針對(duì)性疫苗，以加強(qiáng)對(duì)4型禽腺病毒感染的有效防控。因此，本研究利用在黑龍江省發(fā)病雞場(chǎng)分離的4型禽腺病毒(HLJ1701株)進(jìn)行了滅活疫苗的研制。

1 材 料

1.1 毒株 4型禽腺病毒(HLJ1701株)由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院獸藥研究室分離并保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚、種蛋及SPF雛雞購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，自行孵化至適合日齡使用。

1.3 佐劑 注射用白油、司本-80、吐溫-80，均購(gòu)自天津市巴斯夫化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 抗原制備 4型禽腺病毒(HLJ1701株)用生理鹽水作104倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育72 h，24 h內(nèi)死亡為非特異性死亡，廢棄不計(jì)，收獲后測(cè)定LD50應(yīng)不小于10-5.49。按照以上方法分別制備3批病毒液，批號(hào)分別為FAdV4-1、FAdV4-2、FAdV4-3。

2.2 病毒液滅活 4型禽腺病毒(HLJ1701株)病毒液中加入甲醛(終濃度0.3%)，37 ℃滅活24 h，滅活后的病毒液置于2～8 ℃保存。

2.3 半成品檢驗(yàn)

2.3.1 無(wú)菌檢驗(yàn) 按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015版)對(duì)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，檢驗(yàn)不合格應(yīng)廢棄。

2.3.2 病毒含量測(cè)定 將滅活前的病毒，做10倍系列稀釋，0.2 mL/只定量接種2周齡SPF雞，每個(gè)稀釋度接種6只，觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡數(shù)，直至攻毒后14 d，計(jì)算各稀釋度死亡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的百分率。按Reed-Muench法計(jì)算LD50。

2.3.3 滅活檢驗(yàn) 取滅活后的HLJ1701株病毒液，尿囊腔內(nèi)接種9～11日齡SPF雞胚10枚，每胚0.2 mL，37 ℃繼續(xù)孵育，剔除24 h內(nèi)死亡雞胚，觀察3日，雞胚非特異性死亡不應(yīng)超過(guò)2枚。收獲所有雞胚的胚液，頸部皮下接種10只2周齡SPF雞胚，應(yīng)全部無(wú)異常。

2.4 疫苗配制

2.4.1 油相制備 取優(yōu)質(zhì)注射白油96份，司本-80 4份。先將白油緩緩加溫，加入4%的司本-80，邊攪拌邊加溫，直到充分溶解至透明，高壓滅菌備用。

2.4.2 水相制備 取疫苗抗原(滅活雞胚尿囊液)96份加入滅菌后的吐溫-80 4份，開(kāi)始攪拌直至全部溶解為止，制成水相。

2.4.3 乳化 將油相與水相按2∶1的比例利用IKA乳化機(jī)25000 r/min乳化5 min。批號(hào)分別為20170711、20170824、20170913。

2.5 成品檢驗(yàn)

2.5.1 性狀 按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄對(duì)疫苗的外觀、劑型、穩(wěn)定性和黏度等性狀進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.5.2 裝量檢查 按《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行裝量檢查。

2.5.3 無(wú)菌檢驗(yàn) 按《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

2.5.4 安全檢驗(yàn) 取3周齡SPF雞15只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗1 mL，觀察14 d，記錄是否出現(xiàn)局部或全身不良反應(yīng)。

2.5.5 效力檢驗(yàn)

2.5.5.1 血清學(xué)方法 取3周齡SPF雞40只，其中30只分別利用3批次疫苗進(jìn)行頸部皮下接種，每批次10只，0.2 mL/只，另10只作不免疫接種對(duì)照。接種后21 d，分別采血分離血清，使用ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。

2.5.5.2 免疫攻毒法 取3周齡SPF雞40只，其中30只分別利用3批次疫苗進(jìn)行頸部皮下接種，每批次10只，0.2 mL/只，另10只作不免疫接種對(duì)照。接種后21 d，將免疫雞連同10只對(duì)照雞，分別通過(guò)皮下接種病毒液，0.2 mL/只(含100 LD50)，連續(xù)觀察10 d后分別采集試驗(yàn)雞的肝臟組織進(jìn)行病毒分離。

3 結(jié)果與分析

3.1 半成品檢驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)室條件下連續(xù)制備了3批病毒液，批號(hào)分別為FAdV4-1、FAdV4-2、FAdV4-3。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3批病毒液的病毒含量(LD50)在10-5.49～10-5.66之間，病毒液經(jīng)0.3%甲醛液在37 ℃滅活24 h后，均可滅活完全(表1)。

表1 病毒液半成品檢驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The detecting result of virus antigen

3.2 性狀檢驗(yàn) 經(jīng)檢驗(yàn)，制備的3批4型禽腺病毒滅活疫苗批號(hào)分別為20170711、20170824、20170913均為乳白色乳劑，油包水型，將疫苗置3000 r/min離心15 min，管底無(wú)水相析出，3批疫苗的黏度均在50 cP以內(nèi)(表2)。

表2 3批實(shí)驗(yàn)室制品性狀檢驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The physical characteristics result of 3 batch of products

3.3 裝量檢查 經(jīng)檢查，所制備的3批次4型禽腺病毒滅活疫苗的裝量均為250 mL以上，符合規(guī)定(表3)。

表3 裝量檢查結(jié)果Tab 3 Filling inspection results

3.4 無(wú)菌檢驗(yàn) 經(jīng)檢驗(yàn)，所制備的3批4型禽腺病毒滅活疫苗均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，檢驗(yàn)合格。

3.5 安全檢驗(yàn) 將所制備的3批4型禽腺病毒滅活疫苗分別經(jīng)頸部皮下接種3周齡SPF雞，試驗(yàn)雞接種后均全部健活，未出現(xiàn)局部或全身不良反應(yīng)。

3.6 效力檢驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，3批4型禽腺病毒滅活疫苗免疫3周齡SPF雞后21 d，抗體平均效價(jià)可達(dá)到28以上，使用4型禽腺病毒(HLJ1701株)進(jìn)行攻毒，攻毒后各免疫雞均全部存活，攻毒10 d后分別采集試驗(yàn)雞的肝臟組織進(jìn)行病毒分離，均為陰性，3批疫苗對(duì)免疫雞的攻毒保護(hù)率均為100%；對(duì)照雞在攻毒后4 d內(nèi)均全部發(fā)病死亡(表4和表5)。

表4 抗體檢測(cè)結(jié)果Tab 4 Results of Antibody test

表5 3批4型禽腺病毒滅活疫苗對(duì)HLJ201701株的攻毒保護(hù)試驗(yàn)Tab 5 The result of virus challenge experiment with strain HLJ201701 of 3 batch virus vaccine

4 討論與結(jié)論

不同于其他大部分禽類病毒，4型禽腺病毒不具備使雞、大鼠和小鼠紅細(xì)胞凝集的能力[7]，不過(guò)Manzoor S 利用人O型紅細(xì)胞血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行了野生鳥(niǎo)類中4型禽腺病毒的血清抗體情況調(diào)查[8]，說(shuō)明4型禽腺病毒能夠使人O型紅細(xì)胞凝集，但是人O型紅細(xì)胞獲取較為困難，不適宜生物制品生產(chǎn)的實(shí)踐應(yīng)用，因此本研究未應(yīng)用凝集試驗(yàn)進(jìn)行抗體滴度檢測(cè)。ELISA方法是實(shí)驗(yàn)室診斷中常用的抗體檢測(cè)方法[9-10]，本研究中利用黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院獸藥研究室建立的ELISA方法對(duì)疫苗抗體進(jìn)行了檢測(cè)[10]，結(jié)果表明ELISA檢測(cè)方法可以完成疫苗抗體檢測(cè)任務(wù)，而且靈敏度高，測(cè)定準(zhǔn)確。

目前已有其他4型禽腺病毒滅活疫苗制備的報(bào)道[11-13]，但疫苗免疫成功最主要的因素之一就是免疫毒株基因型的吻合。本研究利用黑龍江地區(qū)4型禽腺病毒分離株HLJ1701進(jìn)行了滅活疫苗的研制，利用MEGA7軟件進(jìn)行分離株HLJ1701遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示分離株序列與國(guó)外的分離株同源性差異較大，與加拿大分離株(GenBank: GU188428.1)核苷酸序列同源性僅為96.00%，氨基酸同源性僅為88.70%；與Meng K等[13]用于制備滅活疫苗的中國(guó)山東分離株(GenBank: MN102413.1，分離于2017年8月)核苷酸同源性較高，為98.80%，但氨基酸同源性僅為91.40%，其中hexon蛋白第367-395位氨基酸序列有明顯差異。不同地區(qū)分離毒株序列可能具有地域特異性，基因序列的差異引起氨基酸序列的改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，尤其是具備抗原決定簇的hexon蛋白的改變極大可能影響疫苗的免疫效果，因此利用本地區(qū)毒株進(jìn)行疫苗制備更具地域優(yōu)勢(shì)，也更具有針對(duì)性。本研究利用黑龍江地區(qū)分離毒株制備疫苗可能更適于黑龍江地區(qū)4型禽腺病毒的免疫防治。

本研究利用分離株HLJ1701進(jìn)行了滅活疫苗的研制，結(jié)果表明自制的滅活疫苗均符合藥典規(guī)定，而且疫苗的保護(hù)率達(dá)到100%，可以為臨床4型禽腺病毒的疫苗制備及臨床防控提供參考。