張 華，劉 媛，皇甫和平

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.鄭州大學(xué) 物理學(xué)院(微電子學(xué)院)，河南 鄭州 450052)

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，包括腸球菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬、亮串珠菌屬、片球菌屬和鏈球菌屬等，這類細(xì)菌在自然界中的分布極為廣泛[1]。乳酸菌天然存在于某些食品中，參與食品的發(fā)酵過(guò)程，乳酸菌發(fā)酵的生化反應(yīng)涉及一系列酶的反應(yīng)，發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生的變化包括pH值的降低以及代謝產(chǎn)物如乳酸、乙酸、過(guò)氧化氫和肽的產(chǎn)生[2]。食品經(jīng)乳酸菌發(fā)酵有諸多好處：首先，乳酸菌發(fā)酵可以提高食品的消化率；其次，發(fā)酵的次生代謝產(chǎn)物可以抑制病原微生物的生長(zhǎng)，提高食品的安全性；再次，食用乳酸菌發(fā)酵的食品有助于維持腸道的微生物菌群，防止因腸道菌群失調(diào)引起的疾病。由于乳酸菌的這些功效，一些乳酸菌被認(rèn)為是益生菌[3]。

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近一千種(或菌株)，廣泛分布于自然界中。沙門氏菌對(duì)禽類、生豬及其鮮肉制品的感染率很高，蛋類、畜禽類肉制品是人類感染沙門氏菌的主要渠道[4]。頭孢曲松鈉、頭孢他啶等抗生素可以有效地抑制沙門氏菌的繁殖，但濫用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性和動(dòng)物體內(nèi)抗生素殘留等問(wèn)題[5]。益生菌作為抗生素的替代品已被確定為預(yù)防畜禽沙門氏菌感染的策略之一。

本研究以發(fā)酵酸奶中的乳酸菌為菌源，篩選對(duì)沙門氏菌有較強(qiáng)抑制作用的菌株并分析其抑菌原理，以期為利用乳酸菌預(yù)防畜禽沙門氏菌的感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌源

乳酸菌分離自青海省傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶，經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定，用R1-R20表示。沙門氏菌由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院皇甫和平博士贈(zèng)送，分別用S1-S8來(lái)表示。菌源保存于河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯、NA培養(yǎng)基、氫氧化鈉、鹽酸、過(guò)氧化氫等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。胃蛋白?1∶100000)、胰蛋白酶(1∶250)、過(guò)氧化氫酶均購(gòu)自Amersco公司。

1.3 儀器與設(shè)備

pH計(jì)(LC-7H，上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠)。紫外可見分光光度計(jì)(CAAM-1043，蘇州優(yōu)譜通用科學(xué)儀器有限公司)。恒溫培養(yǎng)箱(SDRH-700F，天津勝衛(wèi)電子科技有限公司)。分析天平(FR2333CN，上海奧豪斯有限公司)。電子游標(biāo)卡尺(ADS-X023-05000，安迪斯測(cè)控技術(shù)有限公司)。高速冷凍離心機(jī)(DJSJGI-OLP-26，愛而斯特生命科學(xué)有限公司)。抽濾裝置(R300-B，上海令德儀器有限公司)。高效液相色譜儀(Agilent 1280，PERKIN ELMER)。

1.4 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備

挑取MRS固體平板上形態(tài)飽滿的菌落3～5個(gè)，用接種環(huán)置于 50 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h，用移液槍移取100 μL接種于10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，4 ℃ 6000 g 離心10 min，取上清液，用于后續(xù)牛津杯試驗(yàn)。

1.5 沙門氏菌培養(yǎng)液的制備

將沙門氏菌進(jìn)行菌種活化，用1 mL無(wú)菌生理鹽水溶解菌種，用移液槍移取100 μL涂布于NA 固體培養(yǎng)基上，37 ℃有氧培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落連續(xù)培養(yǎng) 2～3 代，用于后續(xù)牛津杯試驗(yàn)。

1.6 牛津杯法抑菌試驗(yàn)

乳酸菌菌株的初步篩選采用牛津杯法[6]。將20 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入平板中，讓其凝固。將沙門氏菌(過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)，600 nm處光密度為1)注射到5 mL NA瓊脂中，冷卻至50 ℃，接種率為3%。待培養(yǎng)基凝固后，將4個(gè)滅菌后的牛津杯輕輕壓在NA瓊脂表面，每個(gè)牛津杯中加入250 μL乳酸菌發(fā)酵離心上清液(已培養(yǎng)了24 h)，37 ℃孵育24 h，測(cè)定抑菌圈的直徑。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 酸抑制排除試驗(yàn)

用1 mol/L NaOH將乳酸菌發(fā)酵離心上清液的pH值調(diào)整為4、5、5.5、6。用牛津杯法做抑菌試驗(yàn)，37 ℃孵育24 h后測(cè)定抑菌圈的直徑。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.8 蛋白酶和過(guò)氧化氫酶對(duì)乳酸菌抗菌活性的影響

將胃蛋白酶溶解在pH2.0的磷酸緩沖液中，將胰蛋白酶溶解在pH7.0的磷酸緩沖液中。取2份等量的乳酸菌發(fā)酵上清液，將pH分別調(diào)為2.0(胃蛋白酶最適pH)、7.0(胰蛋白酶最適pH)，按照最終濃度1.0 mg/mL加入胃蛋白酶溶液或胰蛋白酶溶液，37 ℃溫浴2 h后取出，沸水煮沸5 min使酶滅活，pH值調(diào)整為6.0。以未經(jīng)酶處理的乳酸菌發(fā)酵上清液作對(duì)照。用牛津杯法做抑菌試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈的直徑。

過(guò)氧化氫酶溶解在50 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，然后按照最終濃度1 mg/mL加入到乳酸菌發(fā)酵上清液中，37 ℃溫浴2 h后取出，沸水煮沸5 min使酶滅活，pH值調(diào)為6.0。以未經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理的乳酸菌發(fā)酵離心上清液作對(duì)照。用牛津杯法做抑菌試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈的直徑[7]。

1.9 產(chǎn)酸能力曲線

篩選出抑菌效果較好的乳酸菌菌株，每10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基接種40 μL菌液(1×109CFU/mL)，37 ℃靜止培養(yǎng)14～16 h。將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液按照1%的接種量接種于500 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，每隔2 h取樣。利用pH計(jì)測(cè)定乳酸菌發(fā)酵上清液的pH值，利用高效液相色譜儀分析乳酸菌發(fā)酵上清液中有機(jī)酸的種類和質(zhì)量濃度[8]。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌發(fā)酵上清液的抑菌效果

20株乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)沙門氏菌的抑制效果如表1所示。不同乳酸菌對(duì)同種沙門氏菌的抑菌效果有差異，同種乳酸菌對(duì)不同沙門氏菌的抑菌效果也有差異。14株乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)沙門氏菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性，其中，R4、R7、R10、R11這4株乳酸菌發(fā)酵上清液的抑菌活性較強(qiáng)，有些抑菌圈直徑在20 mm以上，選取這4株乳酸菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)沙門氏菌的抑菌結(jié)果

2.2 乳酸菌發(fā)酵上清液pH值對(duì)抗菌活性的影響

乳酸菌發(fā)酵上清液pH值對(duì)抗菌活性的影響如表2所示。在pH=4時(shí)，4株乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)沙門氏菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性。與pH=4時(shí)相比，pH=5時(shí)R4對(duì)S6、R7對(duì)S3和S4、R10對(duì)S7、R11對(duì)S5的抗菌活性降低。在pH=5.5或6時(shí)，未檢測(cè)到乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)沙門氏菌的抗菌活性，說(shuō)明此時(shí)乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)沙門氏菌的抗菌活性喪失。

表2 乳酸菌發(fā)酵上清液的pH值對(duì)乳酸菌抗菌活性的影響

2.3 蛋白酶和過(guò)氧化氫酶處理對(duì)乳酸菌發(fā)酵上清液抗菌活性的影響

胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后的乳酸菌發(fā)酵上清液無(wú)抗菌作用。乳酸菌在代謝過(guò)程中可能產(chǎn)生過(guò)氧化氫，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)，用過(guò)氧化氫酶處理乳酸菌發(fā)酵上清液以探明過(guò)氧化氫對(duì)乳酸菌發(fā)酵上清液抗菌活性的影響。經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后，所有乳酸菌發(fā)酵上清液的抗菌活性均未喪失(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.4 產(chǎn)酸能力

4株乳酸菌產(chǎn)酸能力及乳酸菌發(fā)酵上清液pH的動(dòng)態(tài)變化如圖1所示。MRS肉湯初始pH為5.85。在48 h的發(fā)酵過(guò)程中，0～8 h乳酸菌生長(zhǎng)緩慢，乳酸和乙酸產(chǎn)生速率無(wú)明顯變化，但pH開始下降；8～16 h乳酸菌生長(zhǎng)加速，乳酸和乙酸產(chǎn)生速率增大，pH急劇下降；16～24 h乳酸菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，斜率最大，產(chǎn)乳酸、乙酸能力強(qiáng)，pH緩慢下降；24 h后乳酸菌進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，產(chǎn)酸能力穩(wěn)定，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH基本保持穩(wěn)定。

圖1 菌株產(chǎn)酸能力

3 討論

沙門氏菌是常見的條件性致病菌之一，其血清型眾多，對(duì)人和動(dòng)物有致病性，還會(huì)污染畜禽產(chǎn)品[9,10]。沙門氏菌毒性因子包括鞭毛蛋白、毒力島、生物膜等[11]。在細(xì)胞外壁包被著一個(gè)重要的脂質(zhì)多糖復(fù)合物-脂多糖(Lipopoly-saccharide，LPS)，LPS在沙門氏菌感染發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[12,13]，LPS層形成一個(gè)緊密的屏障，能夠阻擋包括抗生素在內(nèi)的許多化合物[14,15]，給沙門氏菌病的防控帶來(lái)困難。

本試驗(yàn)中，4株乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)8株沙門氏菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后，4株乳酸菌發(fā)酵上清液的抗菌活性未喪失，證實(shí)乳酸菌的抗菌活性與過(guò)氧化氫的產(chǎn)生無(wú)關(guān)。蛋白酶處理后的乳酸菌發(fā)酵上清液無(wú)抗菌作用，說(shuō)明胃蛋白酶和胰蛋白酶水解了抗菌物質(zhì)。

在pH=4時(shí)，4株乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)沙門氏菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性；將4株乳酸菌發(fā)酵上清液的pH值調(diào)整到5時(shí)，其對(duì)沙門氏菌的抑菌活性降低；將4株乳酸菌發(fā)酵上清液的pH值調(diào)整到5.5或6時(shí)，其對(duì)沙門氏菌的抑制作用喪失。上述結(jié)果說(shuō)明，有機(jī)酸具有抑菌作用，或源自乳酸菌的抑菌物質(zhì)在酸性條件下才能發(fā)揮作用。產(chǎn)酸能力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵液中含有乳酸、乙酸。前期研究表明，乳酸菌發(fā)酵液中含有乳酸、乙酸或苯乳酸等有機(jī)酸及短鏈脂肪酸[16]。

總之，奶源乳酸菌的抑菌作用與發(fā)酵上清液中的酸性物質(zhì)有關(guān)。乳酸菌的抑菌作用可能涉及多種機(jī)制的協(xié)同，例如有文獻(xiàn)表明細(xì)菌素在酸性條件下才具有抗菌活性[17]，因此對(duì)協(xié)同機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。