金前躍，王寅彪，馮麗麗，李華瑋，郭振華，邢廣旭，張改平,4

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,公共衛(wèi)生學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南鄭州 450002；4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450002；5.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)以母豬繁殖障礙及豬群呼吸困難為主要特征，在世界范圍內(nèi)流行并嚴(yán)重制約養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。20世紀(jì)90年代，科學(xué)家們從臨床患病豬身上分離到病毒，確定了引起該病的主要病原體為PRRSV[2, 3]。PRRSV為有囊膜RNA病毒，屬動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)，動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)，根據(jù)分子生物學(xué)特征分為歐洲型(I型)和美洲型(II型)[4-6]。1996年，我國(guó)首次分離到該病毒，研究發(fā)現(xiàn)為美洲型[7]。2006年，新型的毒力更強(qiáng)的美洲型PRRSV在我國(guó)十幾個(gè)省廣泛流行[8]。盡管我國(guó)報(bào)道的PRRSV大多屬于美洲型，但是新的歐洲型PRRSV也開(kāi)始在我國(guó)流行[9]。因此，有必要建立PRRSV血清抗體檢測(cè)方法以用于該病的流行病學(xué)調(diào)查；而且，為了對(duì)PRRSV的疫苗效力及PRRS疾病進(jìn)程進(jìn)行判斷和評(píng)價(jià)，建立PRRSV中和抗體的檢測(cè)方法亦是十分必要。

GP5蛋白是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在病毒中和方面起重要作用[10, 11]。該蛋白為跨膜蛋白，其胞外區(qū)與M蛋白胞外區(qū)構(gòu)成異源二聚體[12-14]。GP5-ecto與M蛋白胞外區(qū)形成的異源二聚體能夠介導(dǎo)PRRSV入侵宿主細(xì)胞，其中GP5蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體的功能是提供免疫保護(hù)，M蛋白則誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫，因此，GP5蛋白是良好的亞單位疫苗設(shè)計(jì)靶標(biāo)[15-19]。Plagemann等利用重疊多肽合成技術(shù)證實(shí)PRRSV主要中和表位在GP5-ecto的中間部位[20, 21]，故GP5-ecto成為建立檢測(cè)PRRSV中和抗體的首選靶標(biāo)。

本研究以GP5-ecto基因?yàn)閷?duì)象，通過(guò)基因合成技術(shù)串聯(lián)合成該基因片段，利用大腸埃希氏菌E.coliBL21(DE3)對(duì)該片段進(jìn)行表達(dá)，并純化獲得具有良好免疫原性的蛋白。本研究為PRRSV中和抗體ELISA檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、載體和菌株

PRRSV河南株HN07-1(GenBank No. FJ147205.1)、MARC-145細(xì)胞、原核表達(dá)載體pET28a、大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞JM109和E.coliBL21(DE3)、PRRSV陽(yáng)性血清及陰性血清由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶及主要試劑

Premix ExTaq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TAKARA；DNA連接試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN；HRP標(biāo)記二抗、His單抗購(gòu)自北京博奧森；IPTG購(gòu)自華美公司；DMEM培養(yǎng)基及新生胎牛血清購(gòu)自SOLARBIO；弗氏完全及不完全佐劑購(gòu)自GIBCO。

1.2 方法

1.2.1 PRRSV-GP5胞外區(qū)基因的串聯(lián)合成

本實(shí)驗(yàn)將PRRSV HN07-1株GP5蛋白的胞外區(qū)在基因水平上進(jìn)行串聯(lián)連接，引入BamH I和XhoI的酶切位點(diǎn)。GP5-ecto序列交由生工生物工程(上海)有限公司合成并克隆到載體pBluescript II SK+上，以下為對(duì)應(yīng)的氨基酸序列：SNNSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLTQKFDWAHHHHHHH

HSNNSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLTQKFDWA。

1.2.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-GP5-ecto的構(gòu)建及鑒定

使用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切將GP5-ecto序列從pBluescript II SK+載體上切除后與同樣經(jīng)BamH I和XhoI雙酶切的pET28a載體用DNA連接試劑盒進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物pET28a-GP5-ecto轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，涂布Kan+抗性的LB固體平板，置于37 ℃培養(yǎng)并挑選單克隆菌落。鑒定后的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)并挑取單克隆菌落用以誘導(dǎo)重組蛋白GP5-ecto的表達(dá)。

1.2.3 重組蛋白GP5-ecto的表達(dá)、純化及免疫原性鑒定

將含重組質(zhì)粒pET28a-GP5-ecto的陽(yáng)性單克隆菌落在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6～1時(shí)，以終濃度為0.5 mM的IPTG，在37 ℃條件下誘導(dǎo)4 h。通過(guò)SDS-PAGE鑒定GP5-ecto蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況，并用Western blot鑒定GP5-ecto蛋白與PRRSV陽(yáng)性豬血清的反應(yīng)。使用Ni-NTA親和層析對(duì)GP5-ecto蛋白進(jìn)行純化并采用尿素濃度梯度復(fù)性后，使用ELISA檢測(cè)方法鑒定其與PRRSV陽(yáng)性豬血清的反應(yīng)情況，以此來(lái)判定GP5-ecto蛋白的免疫原性。

ELISA檢測(cè)方法如下：將純化蛋白以不同濃度在4 ℃進(jìn)行過(guò)夜包被；PBST清洗3次，5%脫脂奶于37 ℃封閉1 h；PBST清洗3次，加入1∶400稀釋的陽(yáng)性及陰性血清，37 ℃下孵育0.5 h；PBST清洗3次，加入1∶1000倍稀釋的兔抗豬HRP-IgG，37 ℃孵育0.5 h；PBST清洗3次，使用TMB顯色液進(jìn)行顯色，酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 重組蛋白GP5-ecto的BALB/c小鼠免疫及IFA試驗(yàn)

使用純化后的GP5-ecto蛋白免疫SPF級(jí)6～8周齡雌性BALB/c小鼠，共免疫3只，進(jìn)行3次免疫。首免使用弗氏完全佐劑與GP5-ecto蛋白乳化，采用背部皮下多點(diǎn)注射的方法每只注射50 ng蛋白。7天后，進(jìn)行二免，使用弗氏不完全佐劑與GP5-ecto蛋白乳化，采用同上劑量進(jìn)行免疫。14天后，進(jìn)行三免(方法同二免)。三免10天后采集小鼠血清，使用IFA檢測(cè)GP5-ecto蛋白免疫后的小鼠血清是否具有與天然PRRSV病毒蛋白反應(yīng)的能力。

IFA檢測(cè)方法如下：將MARC-145細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)至80%左右，接種PRRSV HN07-1病毒；感染48 h后，棄去上清，用預(yù)冷PBST清洗3次，含0.3%H2O2的預(yù)冷甲醇溶液固定15 min；棄固定液，PBST清洗3次，5%脫脂奶37 ℃封閉1 h；PBST清洗3次，加入1∶100倍稀釋的免疫血清和PRRSV陽(yáng)性及陰性血清，37 ℃孵育1 h；PBST清洗3次，分別加入1∶100倍稀釋的羊抗鼠FITC-IgG或兔抗豬FITC-IgG，37 ℃孵育1 h；PBST清洗3次，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-GP5-ecto的鑒定

重組質(zhì)粒pET28a-GP5-ecto經(jīng)NdeI和XhoI、BamHI和XhoI兩組雙酶切鑒定后均出現(xiàn)特異目的條帶，表明重組質(zhì)粒連接成功(圖1)。

M. DL 2000 (Marker); 1. BamH I和Xho I雙酶切;2. Nde I和Xho I雙酶切圖1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-GP5-ecto的鑒定

2.2 重組蛋白GP5-ecto的表達(dá)、純化及Western blot鑒定

SDS-PAGE對(duì)重組蛋白GP5-ecto的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)在12 kDa左右(理論計(jì)算值為12.3 kDa)有一條新出現(xiàn)的蛋白條帶。而且在37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0時(shí)，以終濃度為0.5 mM的IPTG誘導(dǎo)4 h后，重組GP5-ecto蛋白實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。Ni-NTA親和層析純化后，采用不同濃度梯度的尿素進(jìn)行復(fù)性。Western blot表明GP5-ecto蛋白能與PRRSV HN07-1陽(yáng)性豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖2)。

M. 低分子量蛋白質(zhì)Marker; A. 1～4, SDS-PAGE鑒定GP5-ecto蛋白的表達(dá); B. 1～3, Western blot鑒定純化后的GP5-ecto圖2 重組蛋白GP5-ecto的純化及Western blot鑒定

2.3 重組蛋白GP5-ecto的免疫原性鑒定

實(shí)驗(yàn)運(yùn)用ELISA方法鑒定重組GP5-ecto蛋白的免疫原性，將不同濃度蛋白過(guò)夜包被后， 以PRRSV陽(yáng)性血清作為一抗進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：重組蛋白能與陽(yáng)性血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，最低包被濃度達(dá)0.125 μg/mL，說(shuō)明該純化蛋白免疫原性較好(圖3)。

2.4 IFA

在重組GP5-ecto蛋白免疫BALB/c小鼠后，采集小鼠血清，以PRRSV HN07-1株的陽(yáng)性血清作為陽(yáng)性對(duì)照，采用IFA實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠血清與病毒的反應(yīng)性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，免疫血清能與病毒發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明重組蛋白與病毒天然蛋白結(jié)構(gòu)具有較高的相似性(圖4)。

A. 免疫血清(1∶100); B.陽(yáng)性對(duì)照(1∶100); C. 陰性對(duì)照(1∶100)圖4 IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

我國(guó)現(xiàn)階段存在傳統(tǒng)美洲型PRRSV、高致病性美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV同時(shí)流行的特點(diǎn)，面對(duì)如此嚴(yán)峻的疫病流行形勢(shì)，急需開(kāi)展疫病的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，同時(shí)開(kāi)發(fā)相應(yīng)的診斷技術(shù)及產(chǎn)品。作為PRRSV主要的囊膜蛋白，GP5在PRRSV的診斷、血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及疫苗效力評(píng)價(jià)等方面都具有重要作用。

PRRSV感染后，康復(fù)期的豬血清中的中和抗體主要是針對(duì)GP5的蛋白[11]。GP5蛋白的單克隆抗體在病毒中和方面比GP4蛋白的單克隆抗體更有效[18]。Plagemann等將PRRSV的主要中和表位定位在GP5-ecto的中間部位[20]。Ostrowski等報(bào)道：GP5-ecto區(qū)域包含有中和性的B表位以及非中和性的A表位，而且A表位是免疫優(yōu)勢(shì)表位，在一定程度上抑制了B表位及中和抗體的誘導(dǎo)產(chǎn)生[21]。所有這些研究都表明了GP5蛋白及GP5-ecto區(qū)域在誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)也為使用GP5-ecto區(qū)域作為靶標(biāo)檢測(cè)PRRSV中和抗體提供了重要依據(jù)。

GP5蛋白在重組卡介苗(BCG)、轉(zhuǎn)基因植物及宿主動(dòng)物等系統(tǒng)中均獲得表達(dá)[15, 22, 23]。但考慮到成本及表達(dá)水平，大腸埃希氏菌原核表達(dá)系統(tǒng)是較好的選擇。而GP5蛋白的跨膜區(qū)具有強(qiáng)疏水性，能夠在一定程度上影響其表達(dá)[24]。課題組曾嘗試使用大腸埃希氏菌原核表達(dá)GP5蛋白(僅缺失N端信號(hào)肽)，但發(fā)現(xiàn)重組pET28a-GP5和pET32a-GP5在大腸埃希氏菌E.coliBL21(DE3)及E.coliRosetta細(xì)胞中均不表達(dá)，也從側(cè)面證明了GP5蛋白跨膜區(qū)的存在能夠影響其在大腸埃希氏菌中的表達(dá)。鑒于上述情況，我們?cè)诒狙芯恐欣没蚝铣杉夹g(shù)串聯(lián)合成了GP5蛋白的胞外區(qū)，并利用大腸埃希氏菌E.coliBL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了GP5-ecto蛋白，ELISA和IFA證實(shí)GP5-ecto蛋白具有良好免疫原性。本研究獲得的GP5-ecto蛋白為檢測(cè)PRRSV血清中和抗體的ELISA方法的建立提供了材料。