王根和，吳怡青，吳鵬飛，方 平，左 剛，陳 雍，胡善良，汪曙紅

(黃山市人民醫(yī)院腫瘤科，安徽 黃山 245000)

肺癌是發(fā)病率和致死率第一的腫瘤，而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占其中的80%[1]。隨著研究的深入，腫瘤發(fā)病機(jī)制和分子靶點(diǎn)越來越清晰，使得近些年來晚期非小細(xì)胞肺癌患者的5年生存率有所提高。吉非替尼、厄洛替尼等是表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的代表性藥物，在臨床治療EGFR陽性的非小細(xì)胞肺癌患者中發(fā)揮了重要作用[2]。然而，獲得性耐藥是患者及臨床醫(yī)師最終不可避免的難題，雖然既往研究效果良好，但是仍有可能發(fā)生病情進(jìn)展[3]。而在對相關(guān)耐藥機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)TKI治療耐藥后，以血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)/EGFR通路為主的血管通路系統(tǒng)會被腫瘤細(xì)胞激活，且會上調(diào)VEGF的表達(dá)[4]。部分臨床研究證實(shí)，VEGF和EGFR通路雙阻斷可以延緩耐藥或一定程度上逆轉(zhuǎn)耐藥，甚至還能提高療效。作為一種人工合成的谷氨酸衍生物，沙利度胺能抑制部分由堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和VEGF介導(dǎo)的腫瘤血管生成，還能夠抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及整合素的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]。沙利度胺在臨床上早已被用于治療多發(fā)性骨髓瘤等一系列腫瘤。前期研究結(jié)果表明，沙利度胺有部分逆轉(zhuǎn)一代TKI耐藥的作用，能延長更換一代TKI的時間，對TKI治療進(jìn)展緩慢的患者具有一定意義[6-7]。為研究沙利度胺逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制是否與bFGF和VEGF有關(guān)，作者設(shè)計了本研究，希望從分子機(jī)制上分析逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制，或者提供較為敏感的預(yù)測因素。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年1月1日至2015年12月31日本院收治的病理證實(shí)為晚期非小細(xì)胞肺癌患者52例作為研究對象。初始EGFR-TKI(一代TKI:吉非替尼、厄洛替尼或?？颂婺?治療后由影像學(xué)等檢查證實(shí)疾病進(jìn)展，在不停用TKI基礎(chǔ)上聯(lián)合使用沙利度胺治療。所有患者臨床資料均完整，臨床病理特征見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者疾病進(jìn)展判定均經(jīng)影像學(xué)檢查證實(shí)；(2)聯(lián)合治療過程中，無局部治療因素(如手術(shù)等)；(3)所有患者體力狀況評分(PS評分)均小于或等于3分，且至少有1個可測量病灶；(4)其他相關(guān)指標(biāo)如心電圖、血常規(guī)、肝功能、腎功能等均正常；(5)符合JACKMAN等[8]關(guān)于EGFR-TKI繼發(fā)性耐藥的定義。本試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

表1 患者臨床病理特征

1.2方法 主要評估指標(biāo)和研究終點(diǎn)為腫瘤緩解率和無疾病進(jìn)展時間(PFS)，次要研究指標(biāo)和終點(diǎn)為血清bFGF和VEGF的變化。在沙利度胺服用前(治療前)及確認(rèn)疾病進(jìn)展時(治療后)留取血清標(biāo)本進(jìn)行VEGF和bFGF檢測。VEGF和bFGF檢測試劑盒均為武漢博士德公司產(chǎn)品。檢測原理：均采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，預(yù)包被捕獲抗體于酶標(biāo)板上,當(dāng)加入標(biāo)本時,被檢測物與預(yù)包被抗體相結(jié)合,其他游離成分則通過洗滌被除去。加入生物素化的抗人抗體,形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體型夾心的免疫復(fù)合物。加入帶有辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。親和素與生物素特異性結(jié)合,親和素連接的酶與夾心的免疫復(fù)合物相連接;游離的其他成分通過洗滌被除去。最后加入顯色劑顯色,形成夾心的免疫復(fù)合物,酶催化顯色劑氧化成為藍(lán)色物質(zhì),在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測,讀取其在450 nm處的A值,通過參考品繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,對照未知樣本中的A值,即可測算出標(biāo)本中被檢測濃度。具體步驟按說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1臨床療效 經(jīng)一代TKI治療進(jìn)展聯(lián)合沙利度胺治療后，所有患者中，完全緩解(CR)0例，部分緩解(PR)4例，病情穩(wěn)定(SD)16例，有效率(CR+PR)為7.7%，疾病控制率(CR+PR+SD)為38.5%。

2.2生存分析 全組隨訪率100%。在對生存分析時發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療后中位PFS是7周(3～44周)，中位總生存時間(OS)為108周(52～240周)。

2.3血清VEGF和bFGF檢測結(jié)果 血清VEGF和bFGF檢測結(jié)果顯示，PR+SD治療后血清VEGF和bFGF水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而PD治療前后比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PFS≥44周患者，治療前后血清VEGF和bFGF水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對于性別和轉(zhuǎn)移部位等因素，治療前后VEGF和bFGF水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2～5。

表2 不同療效分組血清VEGF和bFGF水平比較

表3 不同性別分組血清VEGF和bFGF水平比較

表4 TKI治療后PFS分組血清VEGF和bFGF水平比較

表5 轉(zhuǎn)移部位數(shù)分組血清VEGF和bFGF水平比較

3 討 論

EGFR-TKI藥物應(yīng)用于臨床治療后，為EGFR突變型晚期非小細(xì)胞肺癌患者帶來較好療效，然而，大多數(shù)患者在經(jīng)歷9～13個月的治療后[8]，會遭遇藥物耐藥的難題。目前已知的耐藥性機(jī)制有以下數(shù)點(diǎn)[9]：(1)EGFR通路的改變。所有的通路突變中，T790M突變是最常見的，另外D761Y(外顯子19)、T854A(外顯子21激活環(huán))和L747S(外顯子19)也被發(fā)現(xiàn)與耐藥機(jī)制有關(guān)。(2)旁路激活。包括c-Met基因擴(kuò)增，肝細(xì)胞生長因子(HGF)介導(dǎo)的MET活化，胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)介導(dǎo)的EGFR下游通路激活等。(3)其他，如腫瘤誘導(dǎo)的非EGFR依賴性血管生成。(4)組織類型轉(zhuǎn)化，如3%～14%的EGFR-TKI繼發(fā)耐藥患者會由腺癌轉(zhuǎn)化為小細(xì)胞肺癌。

對EGFR-TKI獲得性耐藥機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，在耐藥細(xì)胞中，以VEGF/EGFR通路為主的血管通路系統(tǒng)被激活，提高了VEGF表達(dá)。VEGF在腫瘤血管生成過程中的重要作用已被證實(shí)，其可結(jié)合并激活酪氨酸激酶受體(廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面)，通過一系列信號通路，最終誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移、細(xì)胞間質(zhì)蛋白水解等，從而參與血管和淋巴管的生成，調(diào)節(jié)腫瘤整個生長過程。有關(guān)研究針對VEGF/EGFR雙阻斷已經(jīng)證實(shí)能夠提高療效。Ⅱ期試驗(yàn)JO25567[10]針對EGFR陽性非鱗非小細(xì)胞肺癌患者，采用貝伐單抗和厄洛替尼聯(lián)合治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組PFS明顯延長，中位PFS對比為9.7個月vs.16個月(P=0.001 5)。亞組分析時，19外顯子突變的患者中也發(fā)現(xiàn)陽性意義，提示聯(lián)合阻斷治療對患者有益。

新生血管對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有極其重要的作用。在有關(guān)血管生成的假說中，最為重要的是血管開關(guān)平衡假說。該假說認(rèn)為，相關(guān)促血管因子的合成和釋放是一種啟動因素，開關(guān)的開閉由誘導(dǎo)蛋白活性和生物利用度、促血管基因表達(dá)介導(dǎo)，相關(guān)因子表達(dá)提高則打開開關(guān)，否則關(guān)閉開關(guān)。目前，已知的相關(guān)調(diào)控因子有白細(xì)胞介素(IL)-8、多效生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、bFGF、MMP、VEGF、整合素等。

在最重要的血管促進(jìn)因子VEGF家族中，共有A、B、C、D、E等5個亞型和胎盤生長因子(PIGF)。其分別與血管生成、維持血管存活、腫瘤淋巴管生成相關(guān)聯(lián)。

bFGF屬于FGF家族，在人體多種正常組織中廣泛存在，其重要作用主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)機(jī)體的胚胎發(fā)育與分化、修復(fù)損傷組織、促進(jìn)血管生成及幫助創(chuàng)傷愈合等。其也被發(fā)現(xiàn)存在多種腫瘤組織中，具有誘導(dǎo)新血管生成、促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂等作用，與腫瘤新生血管及腫瘤生物學(xué)活動密切相關(guān)。

有證據(jù)表明，沙利度胺能夠抑制由bFGF和VEGF介導(dǎo)的腫瘤血管生成、TNF-α和整合素的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。VERHEUL等[11]相關(guān)研究證實(shí)，沙利度胺能夠抑制腫瘤細(xì)胞分泌的血管生長刺激因子，從而抑制腫瘤血管生成，導(dǎo)致腫瘤凋亡，這其中就包括bFGF和VEGF。

本研究結(jié)果表明，對于從聯(lián)合治療中獲益的患者，血清VEGF和bFGF水平在治療前后比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明聯(lián)合治療能抑制VEGF和bFGF，從而抑制一代TKI耐藥后的VEGF通路激活。而這種差異在沙利度胺治療無效的患者中不明顯。在亞組分析中，PFS≥44周的患者，血清VEGF和bFGF水平在沙利度胺治療后明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而PFS<44周的患者血清VEGF和bFGF水平在治療前后比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明TKI治療期間緩慢進(jìn)展的患者，VEGF通路激活可能在耐藥過程中起主要作用。綜上所述，沙利度胺可能是通過抑制bFGF和VEGF介導(dǎo)的血管生成，在一定程度上逆轉(zhuǎn)TKI耐藥，而TKI治療期間進(jìn)展緩慢的患者可能從此方案中獲益。