劉旭瑩，喬利英，劉建華，楊凱捷，趙弼時(shí)，王 鳳，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

綿羊肉質(zhì)細(xì)嫩，蛋白質(zhì)含量高，膽固醇含量低，富含人體必需的各種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)元素等，廣受消費(fèi)者喜歡。脂肪作為維持機(jī)體能量代謝平衡的重要組織，可儲(chǔ)存機(jī)體攝入的過多能量，在能量攝入不足時(shí)為機(jī)體提供能量?jī)?chǔ)備，但過多的脂肪組織沉積會(huì)影響家畜的胴體品質(zhì)。因此探究脂肪代謝調(diào)控關(guān)鍵因子顯得尤為重要。

腫瘤蛋白翻譯控制1（Tumor Protein，Translationally-Controlled 1，TPT1）又稱翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）、組胺釋放因子（HRF）、P21、P23，TPT1 在小鼠肉瘤細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)[1]，參與細(xì)胞增殖[2]、遷徙[3]、凋亡[4-5]等過程。TPT1 蛋白包含1 個(gè)β-折疊，1 個(gè)H2-H3 螺旋以及1 個(gè)柔性環(huán)狀結(jié)構(gòu)域[6]，可以單體蛋白質(zhì)形式在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[7]，也可以二聚體形式作為分泌因子發(fā)揮免疫功能[6]。近年來，不少研究表明，TPT1基因參與糖和脂質(zhì)代謝過程。例如，在豬的前體脂肪細(xì)胞增殖分化研究中發(fā)現(xiàn)，TPT1基因表達(dá)趨勢(shì)先升后降，抑制TPT1基因表達(dá)能引起脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)量升高，促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞的分化[8]。葡萄糖可誘導(dǎo)TPT1表達(dá)量上升并部分轉(zhuǎn)位至線粒體與細(xì)胞核[9]。另外，高脂可通過CD36-Fyn-LKB1-AMPK 信號(hào)通路使胰島β細(xì)胞中TPT1基因表達(dá)水平下降，進(jìn)而導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡[10]。研究證實(shí)，在人的肝細(xì)胞中敲除TPT1基因，肝細(xì)胞再生發(fā)生障礙，脂質(zhì)代謝異常[11]。BMP2 介導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的過程中，下調(diào)TPT1基因表達(dá)可抑制脂肪細(xì)胞的形成[12]。綜上所述，TPT1基因參與糖與脂質(zhì)代謝過程。因此，克隆綿羊TPT1基因，研究TPT1基因表達(dá)與脂質(zhì)代謝之間的關(guān)系，可為改善羊肉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

近幾年對(duì)TPT1基因的研究焦點(diǎn)主要集中在癌細(xì)胞上，在家畜中的研究鮮有報(bào)道。本課題組前期測(cè)序結(jié)果表明，TPT1基因在不同品種的綿羊脂肪細(xì)胞中表達(dá)差異顯著[13]。基于上述研究，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選4 頭12 月齡的小尾寒羊，提取組織RNA，克隆TPT1基因完整的編碼區(qū)（Coding Sequence，CDS），采用生物信息分析軟件對(duì)克隆序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)該基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織中的表達(dá)水平，為深入了解脂肪發(fā)育機(jī)制提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 在屠宰場(chǎng)中隨機(jī)挑選4 頭12 月齡的小尾寒羊，屠宰過程中收集心、肝、脾、肺、腎、脂肪和肌肉組織，分裝于2 mL 的凍存管并快速置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）和pMD18-T 載體均 購(gòu)自日 本TaKaRa 公司；氯仿、異丙醇和無水乙醇均購(gòu)自天津宇博精細(xì)化工；50×TAE 和瓊脂糖均購(gòu)自北京索萊寶公司；2×Taq Master Mix、限制性內(nèi)切酶EcoiI和BamH I購(gòu)自北京百萊博科技有限公司；T4 連接酶購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司；DNA 膠回收純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega 公司。

1.3 組織RNA 提取 Trizol 法提取心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織總RNA；用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的RNA 濃度和OD260nm/OD280nm值。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 上提供的綿羊TPT1基因序列（XM_015098053.2），利用Primer Primier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并送至Thermo Fisher 公司進(jìn)行引物合成，引物序列如表1 所示。

1.5 cDNA 的制備 反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL；RNA 500 ng，然后用RNase-free H2O補(bǔ)足至10 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：37℃ 15 min；85℃ 5 s。反應(yīng)完畢，收集產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物信息

1.6 綿羊TPT1基因的克隆及測(cè)序 用已提取出的RNA和合成引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增出TPT1基因CDS 區(qū)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，對(duì)鑒定正確的PCR產(chǎn)物切膠，根據(jù)DNA 膠回收純化試劑盒說明書對(duì)目的片段進(jìn)行純化回收。將pMD18-T 載體與回收純化的目的基因片段按照載體連接說明書操作要求充分混勻后密封，在PCR 儀中16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，12～16 h 后觀察平板菌落，篩選單個(gè)的陽(yáng)性克隆菌落至液體培養(yǎng)基中，過夜搖菌并送至Thermo Fisher 公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7TPT1基因的生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN 軟件分析TPT1基因的核苷酸序列；利用DNAstar 軟件將測(cè)序結(jié)果與人（NM_001286272.1）、小鼠（NM_009429.3）、大鼠（NM_053867.1）、牛（NM_001014388.1）、豬（NM_214373.1）、山羊（XM_018056766.1）、兔子（NM_001082129.2）這些物 種TPT1基 因mRNA 序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并用Mega7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用DNAstar 將測(cè)序結(jié)果翻譯為氨基酸序列；利用ProtParam Tool（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)TPT1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）對(duì)TPT1蛋白親疏水性進(jìn)行分析；利用Net Phos3.0 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）軟件對(duì)TPT1 蛋白進(jìn)行磷酸化分析；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）軟件預(yù)測(cè)TPT1 的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建TPT1 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以綿羊各個(gè)組織的cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：TB Green Premix Ex Taq II 添加量為10 μL，ddH2O 6.4 μL，上、下游引 物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃20 s，設(shè)置43 個(gè)循環(huán)，95℃ 5 s，65℃ 1 min，升溫速率5℃/s，從65℃遞增到97℃，反應(yīng)至40℃結(jié)束。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 采用2-ΔΔCt方法收集實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05 為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1TPT1基因的擴(kuò)增 以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖1，可見一條約為660 bp 的條帶，與理論擴(kuò)增目的條帶長(zhǎng)度一致。

2.2TPT1基因的核苷酸序列分析 利用DNAMAN 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，TPT1基因CDS 區(qū)長(zhǎng)660 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，A、T、C、G 堿基占比分別為27.0%、25.2%、26.2%、21.7%，AT 含量大于GC 含量。與NCBI 上的綿羊TPT1CDS 區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的TPT1基因在185、555 位發(fā)生了堿基替換（T →C，A →T）。

圖1 TPT1 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3TPT1基因同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 如圖2 所示，綿羊TPT1基因與山羊的同源性最高，同源性為99.7%；與牛的同源性較高，為99.3%；與豬、兔子、小鼠、大鼠、人的同源性分別是92.3%、91.1%、88.4%、88.3%、92.9%；與哺乳動(dòng)物的同源性均在88%以上。

圖2 不同物種間TPT1mRNA 序列同源性比對(duì)

由圖3 可知，綿羊與山羊遺傳距離最近，牛次之，與人遺傳距離最遠(yuǎn)，與物種親緣關(guān)系相一致。

圖3 不同物種TPT1mRNA 序列進(jìn)化樹遺傳距離關(guān)系

2.4 TPT1 蛋白理化性質(zhì)分析 DNAstar 軟件分析結(jié)果表明，TPT1基因CDS 區(qū)編碼219 個(gè)氨基酸，分子式為C1091H1735N297O327S14，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為24 693.41 ku；其中29 個(gè)帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys），32 個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）；pI 為5.89，不穩(wěn)定系數(shù)為43.14，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；總平均親水性為-0.374。

2.5 TPT1 蛋白亞細(xì)胞定位分析 Target P 軟件分析結(jié)果表明，TPT1 蛋白極有可能含有線粒體靶向肽，存在分泌信號(hào)肽的可能性較小。PSORT Ⅱ軟件分析結(jié)果表明，TPT1 蛋白質(zhì)定位于線粒體、細(xì)胞核、過氧化物酶體以及細(xì)胞質(zhì)的占比分別為78.3%、13%、4.3% 和4.3%。這說明TPT1 蛋白可能作為一種線粒體蛋白發(fā)揮作用，在分泌途徑中發(fā)揮作用較少。

2.6 TPT1 蛋白的親疏水性和磷酸化分析 Protscale 軟件分析結(jié)果如圖4 所示，可以看出，TPT1 蛋白所包含的疏水性氨基酸比親水性氨基酸少，說明該蛋白是親水性蛋白。Net Phos3.1 軟件分析結(jié)果見圖5，TPT1 蛋白共有16 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，10 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)，2 個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和4 個(gè)絡(luò)氨酸位點(diǎn)，這說明TPT1 蛋白可能通過不同位點(diǎn)氨基酸的磷酸化發(fā)揮不同的功能。

圖4 TPT1 蛋白親疏水性分析

圖5 TPT1 蛋白磷酸化位點(diǎn)

2.7 TPT1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 如圖6 所示，TPT1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式為α-螺旋（36.07%）、β-轉(zhuǎn)角（7.76%）、無規(guī)則卷曲（37.44%）和延伸鏈（18.72%）。TPT1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建采用SWISS-MODEL，結(jié)果見圖7。

圖6 TPT1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖7 TPT1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果分析 如圖8 所示，TPT1基因在腎臟表達(dá)量最高，心、脾表達(dá)量最低；以腎臟組織為對(duì)照，TPT1基因在各個(gè)組織中表達(dá)量有著顯著差異，肺和脂肪表達(dá)量差異不顯著，心和脾之間差異不顯著。

圖8 TPT1 基因在小尾寒羊各組織間的表達(dá)情況

3 討 論

TPT1基因是一種在進(jìn)化上高度保守的基因，在細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用[4-5,14]。由生物信息學(xué)分析結(jié)果可知，小尾寒羊TPT1基因的完整編碼序列與哺乳動(dòng)物的同源性均在88% 以上，符合生物進(jìn)化特征。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，TPT1 蛋白含無規(guī)則卷曲與α-螺旋較多，這與豬的TPT1 蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果相一致[8]。另外，TPT1 蛋白是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白，大都在線粒體中發(fā)揮功能，這與前人對(duì)該蛋白的亞細(xì)胞定位研究存在差異[15-16]。研究表明，在HeLa 細(xì)胞中，TPT1 蛋白主要定位在細(xì)胞核中，但其蛋白序列中并無明顯的核定位序列[15]；在心肌細(xì)胞中，TPT1 蛋白主要定位于細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)中[16]；這提示TPT1 蛋白可能通過翻譯后修飾來調(diào)控其在細(xì)胞器中的位置。另外，TPT1 蛋白可作為組胺釋放因子在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用，這與本次預(yù)測(cè)結(jié)果有偏差，推測(cè)可能是因?yàn)榘l(fā)揮此功能時(shí)單體TPT1 蛋白形成二聚體所致[6,17]。

眾所周知，當(dāng)細(xì)胞增殖結(jié)束進(jìn)入末端分化時(shí)，一些分化調(diào)控基因的表達(dá)開始上調(diào)，細(xì)胞增殖相關(guān)因子表達(dá)量下調(diào)，隨后細(xì)胞周期永久性退出，因而細(xì)胞增殖相關(guān)因子可作為負(fù)調(diào)控因子調(diào)控前體脂肪細(xì)胞的分化。研究證實(shí)，miR-1236-3p 靶向TPT1基因可抑制細(xì)胞增殖[18]，這說明TPT1基因參與調(diào)控細(xì)胞增殖過程。另外，TPT1基因參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，提示其參與細(xì)胞干性的維持[3]，這說明TPT1基因可能在前體脂肪細(xì)胞分化過程中起著負(fù)調(diào)控作用。研究表明，經(jīng)胰島素處理后的293T 細(xì)胞中，TPT1 蛋白的磷酸化位點(diǎn)發(fā)生了變化[19]，而胰島素參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的糖脂代謝過程，這說明TPT1 蛋白磷酸化位點(diǎn)的變化參與細(xì)胞內(nèi)的糖脂代謝。另外，在外界葡萄糖的刺激下，細(xì)胞質(zhì)中的TPT1 蛋白可向細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移，說明TPT1 蛋白在糖脂代謝中可能是通過核質(zhì)間的位置轉(zhuǎn)變來發(fā)揮功能[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TPT1基因在綿羊心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織中均有不同程度表達(dá)，其中，在腎中表達(dá)量最高，其次是肌肉、肝和脂肪，在心和脾中表達(dá)量最低。在人[15]與豬[8]的研究中發(fā)現(xiàn)，TPT1基因在腎、肌肉、肝、脂肪中表達(dá)量較高，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，反映出TPT1基因在不同組織中均有表達(dá)，且在不同組織中發(fā)揮著不同的作用。

4 結(jié) 論

本研究采用PCR 方法克隆了小尾寒羊TPT1基因的完整編碼序列，生物信息學(xué)分析表明，TPT1 蛋白屬于不穩(wěn)定水溶性蛋白，在線粒體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明，在不同組織中TPT1基因均有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為揭示TPT1基因在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的調(diào)控提供一定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。