秦懷遠(yuǎn)，李和剛，張 寧，辛京京，趙金山

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）源于Ⅱ型微生物適應(yīng)免疫系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中細(xì)菌會(huì)通過(guò)入侵噬菌體和質(zhì)粒來(lái)破壞基因組信息保護(hù)自己[1]。當(dāng)病毒侵入個(gè)體，會(huì)釋放出病毒DNA，當(dāng)細(xì)菌檢測(cè)到病毒DNA 存在時(shí)會(huì)釋放出2 種RNA，其中sgRNA 與病毒DNA 相結(jié)合配對(duì)，另一種RNA 指導(dǎo)合成Cas9 蛋白并與sgRNA 組成復(fù)合物，從而切斷病毒DNA 使其失效[2-3]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)需要通過(guò)識(shí)別在Cas9 靶位點(diǎn)上的一個(gè)原間隔子相鄰基序（PAM）[4-6]序列進(jìn)行特異性靶向基因編輯。目前廣泛使用的化膿性鏈球菌SpCas9 識(shí)別的PAM 為NGG（N為任意堿基，G 為鳥嘌呤），也就是說(shuō)它僅僅能識(shí)別靶向基因組中1/16 的位點(diǎn)[7]，所以NGG 的PAM 并不能滿足對(duì)廣譜基因的編輯需求，因此研究者們?cè)噲D通過(guò)降低PAM 對(duì)CRISPR/Cas9 使用的限制，來(lái)拓寬CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的編輯范圍。

Kleinstiver 等[8]在野生型SpCas9 的基礎(chǔ)上，進(jìn)行R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R 7 個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，成功構(gòu)建出了PAM 僅為NG的Cas9 突變體SpCas9-NG。Hu 等[9]運(yùn)用噬菌體輔助持續(xù)演化（Phage-Assisted Continuous Evolution，PACE）[10]的方法來(lái)進(jìn)化并拓展其識(shí)別的PAM 序列獲得了xCas9。xCas9 比SpCas9 有更高的DNA 靶向特異性，而且將PAM 的限制也降至了NG。Liu[11]團(tuán)隊(duì)證實(shí)xCas9 在兔子中具有擴(kuò)展PAM 兼容性和增強(qiáng)的堿基編輯效率，可用于生物體中的精確基因修飾。而Chatterjee 等[12]發(fā)現(xiàn)一種SpCas9 的直系同源物，來(lái)自犬鏈球菌的ScCas9，其與SpCas9 具有89.2%的同源性，在CRISPR/Cas9 晶體REC3 結(jié)構(gòu)域[13-14]中，于367 至376 位插入了10 個(gè)帶正電荷的氨基酸（IKHRKRTTKL），并且在1 337 和1 338 位置上插入了另外2 個(gè)氨基酸（KQ）[15]，最后PAM 進(jìn)一步放寬至NNGN，而且也有較強(qiáng)的靶向切割活性。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步拓展了CRISPR 系統(tǒng)的靶向范圍。

雖然上述研究已經(jīng)將CRISPR/Cas9 的PAM 限制降低至NG（SpCas9-NG、xCas9 等）以及NNG（ScCas9 等），但是想要更加徹底地使用CRISPR/Cas9 進(jìn)行全基因組的無(wú)限制基因編輯，就必須進(jìn)一步降低PAM 的限制。所以，在本實(shí)驗(yàn)中，ScCas9 在有關(guān)控制PAM 的結(jié)構(gòu)域中多出12 個(gè)氨基酸，在野生型SpCas9 氨基酸序列的基礎(chǔ)上，引入ScCas9 的氨基酸序列特點(diǎn)（插入特定的12 個(gè)氨基酸），期望可以將野生型的SpCas9 的NGG PAM 降低至ScCas9 的NNG PAM；同時(shí)在SpCas9-NG 和xCas9 氨基酸序列的基礎(chǔ)上，引入ScCas9 的氨基酸序列特點(diǎn)（插入特定的12 個(gè)氨基酸），期望能將SpCas9-NG 或xCas9 的PAM（NGN）限制徹底消除。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 迪慶綿羊皮膚成纖維細(xì)胞（DQSHS1）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，目錄號(hào)：KCB90012S；pX330（編碼野生型SpCas9）質(zhì)粒購(gòu)自Addgene 公司，貨號(hào)：#42230，pX330-NG（編碼SpCas9-NG）、pX330-xCas9（編碼xCas9）質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室在pX330基礎(chǔ)上構(gòu)建而成；SSA-DKK2 報(bào)告載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；BbsI 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB 公司，貨號(hào)：R3539S；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa 公司，貨號(hào)：AIG1025A；T4 DNA 連接酶購(gòu)自天根生物公司，貨號(hào)：B0202S；DNA 膠回收試劑盒購(gòu)自天根生物公司，貨號(hào)：DP209-02；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司，貨號(hào)：D6948-01；Lipo 3000 脂質(zhì)體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)：L3 000015；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京原平皓生物科技有限公司，貨號(hào)：LF103-01；DNA 寡核苷酸由擎科公司合成。

1.2 載體構(gòu)建

1.2.1 向?qū)NA 通用表達(dá)載體pCas9-sgRNA 設(shè)計(jì)與構(gòu)建 向?qū)NA 通用表達(dá)載體pCas9-sgRNA 載體依次包含如下元件：

U6 啟動(dòng)子：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTG CATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGG AATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACA AAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGT AGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACT ATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATT TCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAAC ACC

spacer 克隆位 點(diǎn)（2 個(gè)反向 的BbsI 位 點(diǎn)，2 個(gè)BbsI 位點(diǎn)之間插入330 bp 隨機(jī)序列）：

GGGTCTTCG

GGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGT GGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTC TGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTT GTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGC CGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATG CGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTC GGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGA AGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATG GCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGT CGGGGTAGCGGCTGAAGCA

AGAAGACCT

sgRNA 下游序列：GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAA AAAGTGGCACCGAGTCGGTGC

U6 終止子：TTTTTT

bGH polyA：

CTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCT TCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCC CGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCA CTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCG CATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGG TGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTG GGAAGAgAATAGCAGGCATGCTGGGGA

把上述序列插入到pUC57 的EcoR V 位點(diǎn)，此過(guò)程委托青島擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2 靶標(biāo)的設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建 在綿羊基因庫(kù)中找出綿羊DKK2基因（NC_040257.1，21620923～21621362，440 bp），并將其第一外顯子編碼復(fù)制出來(lái)，設(shè)計(jì)NNG PAM、NNN PAM 的靶標(biāo)，合成相應(yīng)的寡核苷酸，其序列信息如表1，引物委托青島擎科生物技術(shù)有限公司合成。

將NNGT1、NNGT2、NNGT3、NNNT1、NNNT2、NNNT3 的上游引物和下游引物兩兩退火，在PCR 儀中進(jìn)行退火過(guò)程。退火條件設(shè)定為95℃ 5 min，72℃ 10 min，后置于冰上，得到6 條雙鏈寡聚核苷酸。

使用BbsI 內(nèi)切酶對(duì)pCas9-sgRNA 通用表達(dá)載體在37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行3 h 的酶切，其中酶切體系為50 μL：5 μL Buffer、2 μL 內(nèi)切酶、28 μL 超純水，15 μL pCas9-sgRNA。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳確定切開后，對(duì)酶切產(chǎn)物的3 300 bp 條帶進(jìn)行切膠回收實(shí)驗(yàn)，將6 條退火的雙鏈寡核苷酸與膠回收產(chǎn)物用T4 連接酶在4℃冰箱進(jìn)行過(guò)夜連接，其中連接體系為10 μL：4 μL 退火引物，4 μL 酶切產(chǎn)物，1 μL T4 連接酶，1 μLBuffer；次日將所得連接產(chǎn)物用DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂板，并將培養(yǎng)皿放置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。

表1 DNA 寡核苷酸序列

挑取單菌落加入到含有1 mL LB（含50 mg/mL 氨芐青霉素）的1.5 mL 離心管中，37℃ 200 rpm 搖菌7～8 h，分別使用NNGT1、NNGT2、NNGT3、NNNT1、NNNT2、NNNT3 的上游引物與特異性反向引物X2-R 進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò) 增，其中PCR 反應(yīng)體系為25 μL：22 μL 金牌mix、1 μL 上游引物、1 μL X2-R、1 μL 菌液。PCR 反應(yīng)參數(shù)為熱蓋105℃，95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，上述過(guò)程循環(huán)29 次，72℃ 5 min，16℃保存。檢測(cè)相應(yīng)單菌落，擴(kuò)增后通過(guò)凝膠電泳，篩選120 bp 左右條帶的陽(yáng)性菌落送往青島擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證（測(cè)序引物為X2-R）。

1.2.3 SpCas9-NNG、ngCas9NNN、xCas9NNN 突變體的構(gòu)建 在原有的野生型SpCas9、突變體SpCas9-NG 和xCas9 的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行ScCas9 中的12 個(gè)氨基酸序列的插入。野生型SpCas9、突變體SpCas9-NG 和xCas9 對(duì)應(yīng)的表達(dá)Cas9 蛋白的氨基酸序列，在367 位置插入IKHRKRTTKL 十肽，在1 337、1 338 2 個(gè)位點(diǎn)插入KQ 二肽。此過(guò)程委托青島擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的綿羊成纖維細(xì)胞，先將細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定培養(yǎng)傳代，在3～5 代細(xì)胞生長(zhǎng)活性較強(qiáng)時(shí)進(jìn)行24 孔板的鋪板。在孔內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到75%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。本次實(shí)驗(yàn)分SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN 3 個(gè)部分，每個(gè)實(shí)驗(yàn)有4 組，分別為對(duì)照組和3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別由pCas9-sgRNA NNNT1、pCas9-sgRNA NNNT2、pCas9-sgRNA NNNT3 與突變體、SSA-DKK2 表達(dá)載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，將未連接sgRNA 的空白通用表達(dá)載體pCas9-sgRNA與突變體、SSA-DKK2 表達(dá)載體作為對(duì)照組，該實(shí)驗(yàn)采用單一變量法，對(duì)照組加未連接靶標(biāo)引物的pCas9-sgRNA 通用表達(dá)載體。其他實(shí)驗(yàn)組分別加入pCas9-sgRNA T1、pCas9-sgRNA T2、pCas9-sgRNA T3。實(shí)驗(yàn)在不同代數(shù)的細(xì)胞重復(fù)轉(zhuǎn)染2 次，轉(zhuǎn)染48 h 后，進(jìn)行雙熒光素酶活性的測(cè)定，以達(dá)到驗(yàn)證3 種突變體是否具有切割活性的目的。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞裂解 將轉(zhuǎn)染48 h 后的24 孔板中的培養(yǎng)基吸出來(lái)，每孔加入100 μL PBS 進(jìn)行潤(rùn)洗，重復(fù)2 次，除去死掉的細(xì)胞以及雜質(zhì)。每孔加入100 μL 稀釋好的細(xì)胞裂解液，常溫靜置30 min 進(jìn)行裂解。

1.4.2 螢火蟲熒光素酶活性測(cè)定 將裂解好的細(xì)胞進(jìn)行柔和吹打混勻，取100 μL Luciferase Assay Reagent 加入Promega GloMax 20/20 發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定管底部，加入20 μL 待測(cè)樣品（裂解好的細(xì)胞），輕輕混勻后，放入儀器中進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 海腎熒光素酶活性測(cè)定 螢火蟲熒光素酶活性測(cè)定之后，直接向取出的離心管中加入100 μL 的終止液SR，輕柔吹打混勻后，放入儀器進(jìn)行檢測(cè)，Stop Reagent 可以立即終止螢火蟲熒光素酶發(fā)光，并且同時(shí)啟動(dòng)海腎熒光素酶發(fā)光反應(yīng)。記錄海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度（RLU2）與螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度（RLU1）的數(shù)值，計(jì)算2 組數(shù)據(jù)的比值，即RLU2/RLU1（簡(jiǎn)寫為R2/R1）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 將雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)RLU1、RLU2 記錄下來(lái)，并計(jì)算R2/R1，記錄于Excel 表格中，計(jì)算試驗(yàn)組3 組的平均值，然后使用t 檢驗(yàn)對(duì)各組結(jié)果差異顯著性進(jìn)行分析（將試驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行比較，試驗(yàn)組之間不做對(duì)比），P≤0.01 為差異極顯著，P≤0.05為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物退火 如圖1 所示，兩條單鏈寡聚核苷酸鏈通過(guò)退火，配對(duì)形成一條20 bp 的雙鏈寡聚核苷酸鏈，通過(guò)凝膠電泳，1～6 個(gè)孔均為明亮單一條帶，說(shuō)明引物退火成功。

圖1 引物退火結(jié)果

2.2 pCas9-sgRNA 酶切如 圖2 所示，pCas9-sgRNA 空載體通過(guò)BbsI 酶切，產(chǎn)生3 300 bp、300 bp 2 條帶，切膠回收3 300 bp 條帶。

圖2 pCas9-sgRNA 酶切結(jié)果

2.3 菌液PCR 及測(cè)序結(jié)果 NNG、NNN 各有3 對(duì)退火引物的連接產(chǎn)物，每組挑5 個(gè)單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR，PCR結(jié)果通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3-A，1～15 為pCas9-sgRNA NNGT1，pCas9-sgRNA NNGT2 以及pCas9-sgRNA NNGT3，其中只有11 顯陰性，其余全為陽(yáng)性，挑選4、5、8、9、12、13 送至青島擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。圖3-B 中，1～15 為pCas9-sgRNA NNNT1、pCas9-sgRNA NNNT2 以及pCas9-sgRNA NNNT3，其中4、5、7、10、14、15 號(hào)孔電泳條帶單一明亮，顯示為陽(yáng)性，送至青島擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖3 菌液PCR 鑒定結(jié)果

2.4 pCas9-sgRNA 靶標(biāo)載體構(gòu)建結(jié)果 如圖4 所示，A、B、C、D、E、F 測(cè)序峰圖表明，靶標(biāo)均準(zhǔn)確連入通用表達(dá)載體pCas9-sgRNA 上，NNG、NNN 2 種PAM 的靶標(biāo)載體pCas9-sgRNAT1、pCas9-sgRNAT2、pCas9-sgRNAT3 構(gòu)建完成。

圖4 靶標(biāo)載體測(cè)序峰圖

2.5 雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果 雙熒光素酶檢測(cè)后，將實(shí)驗(yàn)組結(jié)果與對(duì)照組進(jìn)行SPSS 分析，對(duì)照組無(wú)sgRNA 進(jìn)行引導(dǎo)，所以ngCas9NNN 突變體無(wú)切割效率，而實(shí)驗(yàn)組ngCas9NNN 突變體在sgRNA 的引導(dǎo)下，對(duì)目的基因進(jìn)行了有效的靶向切割，如圖5-A 所示，實(shí)驗(yàn)組1、2 與對(duì)照組相比差異極顯著；實(shí)驗(yàn)組3 與對(duì)照組相比差異顯著。結(jié)果說(shuō)明ngCas9NNN 突變體有顯著的DNA雙鏈切割活性。

林雪川在廣安當(dāng)?shù)亟?jīng)營(yíng)了數(shù)家公司，涵蓋了水業(yè)、建筑、物流、旅游開發(fā)等多個(gè)行業(yè)，但效益一直不好，欠債上千萬(wàn)元。

如圖5-B 所示，xCas9NNN 突變體試驗(yàn)，與對(duì)照組進(jìn)行的雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，只存在一定的切割活性，但活性不高。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告載體檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果

如圖5-C 所示，SpCas9-NNG 突變體試驗(yàn)，與對(duì)照組進(jìn)行的雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，有一定切割活性，但是活性不高。

3 討 論

本研究針對(duì)在PAM 識(shí)別相關(guān)的結(jié)構(gòu)域中，尋找與PAM 識(shí)別有關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)，進(jìn)行氨基酸的突變插入，沒(méi)有進(jìn)行定點(diǎn)突變。實(shí)驗(yàn)是在ScCas9、野生型SpCas9、xCas9 和SpCas9-NG 的基礎(chǔ) 上，將2 種Cas9 蛋白的PAM 限制特點(diǎn)進(jìn)行中和，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，針對(duì)SpCas9-NG和xCas9，在第3 位PAM 的限制蛋白序列中，引入SpCas9-NG 和xCas9 的氨基酸序列特點(diǎn)，在第2 位PAM 的限制蛋白序列中，引入了ScCas9 的第2 堿基的相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域中的氨基酸取代組合，期望進(jìn)一步擴(kuò)大野生型SpCas9、xCas9、SpCas9-NG 的編輯范圍。

在晶體結(jié)構(gòu)分析中，SpCas9 識(shí)別NGG，主要是通過(guò)R1333 和R1335 這2 個(gè)氨基酸分子結(jié)構(gòu)側(cè)鏈與NGG PAM 的第2 位和第3 位的核堿基之間的氫鍵識(shí)別[16]。野生型SpCas9 的氨基酸序列中，E1219 位置上的谷氨酸與R1335 的精氨酸，在空間結(jié)構(gòu)會(huì)形成一個(gè)雙齒鹽橋[17-18]，這個(gè)雙齒鹽橋保持了其對(duì)PAM 第3 位核堿基的識(shí)別穩(wěn)定性，所以在xCas9 的氨基酸序列中，E1219的定點(diǎn)突變（E1219V）是xCas9 降低PAM 識(shí)別限制的至關(guān)重要的突變，它的存在降低了E1219 與R1335的鹽橋的空間作用力，使得R1335 在識(shí)別PAM 過(guò)程中的結(jié)構(gòu)松動(dòng)，放松對(duì)第3 位核堿基G 的識(shí)別，從而使xCsa9 的PAM 限制與野生型SpCas9 相比降至NG。而與野生型SpCas9 的氨基酸序列比較，其他6 個(gè)位點(diǎn)的突變則是為了使xCas9 的DNA 靶向特異性提高。

本研究中，SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN都是在野生型SpCas9、SpCas9-NG 和xCas9 的氨基酸序列基礎(chǔ)上，引入ScCas9 的氨基酸插入特點(diǎn)，最后得到突變體SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN。野生型SpCas9 的PAM 為NGG，只單純的加入12 個(gè)氨基酸，在E1219 位點(diǎn)沒(méi)有進(jìn)行任何突變，所以可能不會(huì)破壞E1219 位置上的谷氨酸與R1335 的精氨酸之間的鹽橋作用力，而且沒(méi)有使Cas9 蛋白放松對(duì)第二位核堿基的識(shí)別，猜想可能由于野生型SpCas9 與ScCas9本身存在的差異，致使野生型SpCas9 僅僅通過(guò)插入12個(gè)氨基酸，并不能降低其對(duì)第2 位核堿基識(shí)別的放松。對(duì)于突變體ngCas9NNN 和xCas9NNN，這兩者本身的氨基酸序列也有著差別，其中在關(guān)鍵的1 219 位點(diǎn)上，兩者的氨基酸也有所不同，xCas9 在野生型SpCas9 基礎(chǔ)上將谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸（E1219V），而SpCas9-NG 則在野生型SpCas9 的基礎(chǔ)上將1 219 位的谷氨酸換成苯丙氨酸（E1219F）。而最近Walton 等[19]利用結(jié)構(gòu)導(dǎo)向工程，通過(guò)一系列的氨基酸取代組合，從中細(xì)化和篩選2 種CRISPR/Cas9 突變體SpG 和SpRY，同樣是為了將PAM 的限制降低，SpG 和SpRY 在E1219的位置也都進(jìn)行了定點(diǎn)突變，他們將谷氨酸換成谷氨酰胺（E1219Q），同樣破壞了鹽橋的作用力，目的都是為了減弱E1219 位置上的谷氨酸與R1335 的精氨酸之間雙齒鹽橋的作用力，但是突變的差異有可能反而對(duì)xCas9NNN 造成了其他的空間作用效果，而對(duì)于突變體SpCas9-NNG 與ngCas9NNN，SpCas9-NNG 本身在1 219位置沒(méi)有任何突變，保持著原始的鹽橋作用力，使其PAM 相關(guān)的結(jié)構(gòu)域本身空間結(jié)構(gòu)就比較堅(jiān)固，空間作用力強(qiáng)，對(duì)于PAM 的特異性識(shí)別難以放松。所以，SpCas9-NNG 和xCas9NNN 切割活性的降低，是否因?yàn)榭刂芇AM 關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的突變差異造成，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

而SpG 和SpRY 在原來(lái)NGG PAM 的基礎(chǔ)上[19]，進(jìn)一步將PAM 的限制降低至NGN 和NRN，甚至在NYN 的位點(diǎn)也表現(xiàn)出了一定的編輯效率。其中除了在E1219 位置的突變特點(diǎn)外，在R1333 上也進(jìn)行了大量的討論，R1333Q 是提高SpRY 切割活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，這將是下一步提高SpCas9-NNG 和xCas9NNN 切割活性的重要提示。

本次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)利用的SSA-DKK2 報(bào)告載體在之前的多次實(shí)驗(yàn)中都取得了穩(wěn)定的效果[20]，為雙熒光素酶檢測(cè)[21]提供了驗(yàn)證基礎(chǔ)。在結(jié)果分析中，僅對(duì)本次插入設(shè)計(jì)的SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN 進(jìn)行了切割活性以及效率的驗(yàn)證，是對(duì)無(wú)PAM 限制的CRISPR/Cas9 編輯系統(tǒng)的初探，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為進(jìn)一步拓展CRISPR/Cas9 的應(yīng)用范圍提供了理論參考，對(duì)于2 種突變體的靶向特異性、脫靶效率及應(yīng)用范圍的驗(yàn)證，還有待進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)中，在野生型SpCas9、SpCas9-NG 和xCas9 氨基酸序列中引入了ScCas9 的氨基酸取代特點(diǎn)，最后得到突變體SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN。通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)報(bào)告得出的結(jié)果，ngCas9NNN 可以識(shí)別NNN PAM 的目的序列，并且可以進(jìn)行有效切割。