姜 琳 孫 興 羅可欣 郭志雄,2 陳桂信,2 佘文琴,2 潘東明,2 潘騰飛,2,*

(1 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2 福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮研究所，福建 福州 350002)

乙烯是一種重要的植物激素，廣泛存在于高等植物中，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用[1]。細(xì)胞的分化如種子萌發(fā)[2]、鱗莖膨大[3]等過程均受乙烯的調(diào)控，尤其是對(duì)半水生植物，乙烯能夠刺激葉片萌發(fā)[4]，以上反應(yīng)是乙烯通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行響應(yīng)的[5]。

乙烯響應(yīng)因子(ethylene response factor，ERF)為植物特有轉(zhuǎn)錄因子，是乙烯傳導(dǎo)途徑中最下游元件[6]，屬AP2/ERF大家族中的其中一個(gè)亞家族[7]。AP2/ERF基因家族龐大，每種植物有100 種以上ERF 轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。ERF作為乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑的最后一個(gè)受體蛋白，能夠激活目標(biāo)基因的表達(dá)，通常參與生物及非生物脅迫的響應(yīng)過程[10]。在眾多的ERF轉(zhuǎn)錄因子中，只有少數(shù)參與乙烯介導(dǎo)的生長(zhǎng)調(diào)控，表現(xiàn)出正調(diào)控和負(fù)調(diào)控功能[11-12]。吳凡等[13]在牡丹(Paeoniasuffruticosa)花瓣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到3個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子，并通過試驗(yàn)表明PsERF1參與乙烯響應(yīng)途徑，PsERF2和PsERF3卻參與多種信號(hào)調(diào)控途徑。

水仙[NarcissustazettaL. var.chinensis(M. Roem.)]是典型的夏休眠球根類花卉，3—5月為球根類花卉鱗莖膨大期，在此期間，種球迅速膨大，是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，為7月下旬的花芽分化積累養(yǎng)分[14-15]。研究表明，一定濃度的乙烯能夠促進(jìn)洋蔥(Alliumcepa)種球的生長(zhǎng)[16]，糖和乙烯共同調(diào)控乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑中CTR1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[17]，但對(duì)ERF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控尚未明確，乙烯對(duì)水仙種球的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的作用也鮮見報(bào)道。為研究乙烯在水仙鱗莖膨大過程中的作用，本試驗(yàn)擬通過測(cè)定種球膨大期乙烯含量的變化，研究ERF基因的表達(dá)規(guī)律，探討其與種球生長(zhǎng)的關(guān)系，以期為進(jìn)一步了解水仙種球的生長(zhǎng)發(fā)育提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以漳州市龍文區(qū)蔡坂村第二年栽培的漳州多花水仙種球?yàn)樵囼?yàn)材料，種球露地栽培。取樣時(shí)期從2018年3月14日至2018年5月13日，每隔10 d取樣一次，分別選取鱗片，內(nèi)芽的組織樣品(取樣部位如圖1所示)，用于乙烯釋放量測(cè)定和基因表達(dá)量分析。所有樣品均設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)。

圖1 多花水仙種球縱切圖

從福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯藏保鮮研究所獲得的水仙種球內(nèi)芽和鱗片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到7個(gè)在種球膨大期間有差異表達(dá)(FDR<0.01且Fold Change≥2)的NtERFs基因。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 多花水仙總RNA提取采用Trizol試劑法；cDNA合成采用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒(大連TaKaRa公司),具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 乙烯氣體釋放量測(cè)定 采用ETD-300乙烯測(cè)定儀(荷蘭Sensor Sense公司)測(cè)定多花水仙乙烯釋放量。乙烯檢測(cè)儀通電預(yù)熱60 min后，打開烴分解器預(yù)熱5 min，分別將鱗片和內(nèi)芽裝進(jìn)樣品室后連接到閥門控制箱，閥門控制箱壓強(qiáng)控制在0.1 MPa，選擇積累測(cè)定模式，測(cè)定流速5 L·h-1。乙烯氣體在樣品室中積累30 min后測(cè)定乙烯釋放量，每組處理重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中得到的NtERFs基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物。采用Beacon Designer軟件設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證基因可行性，引物序列見表1，選用actin為內(nèi)參基因。

表1 ERFs基因qRT-PCR引物序列

1.2.4 qRT-PCR反應(yīng)體系及程序 參照SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNase plus)(大連TaKaRa公司)說明書，使用qtower 3.0定量PCR儀(德國(guó)耶拿公司)進(jìn)行定量分析，PCR反應(yīng)條件為PCR反應(yīng)激活95℃預(yù)變性30 s，95℃ 變性5 s，60℃ 退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT的計(jì)算方法分析相對(duì)表達(dá)量，以第一個(gè)時(shí)期的表達(dá)量為對(duì)照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行樣品間的差異顯著性分析，用Excel制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水仙各部位乙烯釋放量的變化

由圖2可知，從3月份至5月下旬，水仙種球的重量逐漸增加，說明該時(shí)期為水仙的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，種球在不斷增大。在整個(gè)膨大期，不同部位的乙烯釋放量各不相同(圖3)。水仙鱗片的乙烯釋放量在3月下旬至5月上旬之間無顯著差異，5月中旬乙烯釋放量顯著上升，釋放量為0.39 nL·h-1·g-1。內(nèi)芽釋放的乙烯量明顯高于鱗片，乙烯釋放高峰出現(xiàn)在4月下旬(釋放量為7.27 nL·h-1·g-1)，比鱗片提前出現(xiàn)釋放高峰，隨后又呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，到5月中旬略有上升的趨勢(shì)。根據(jù)內(nèi)芽乙烯的釋放規(guī)律推測(cè)，內(nèi)芽釋放的乙烯可能與種球的膨大有關(guān)，且能夠誘導(dǎo)鱗片乙烯的釋放。在漳州地區(qū)，水仙種球的地上部在5月份出現(xiàn)黃化萎蔫，說明水仙種球鱗片乙烯釋放與地上部的衰老有關(guān)。

注：不同小寫字母表示不用時(shí)期的樣品差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 水仙膨大期鱗片NtERFs的表達(dá)規(guī)律分析

定量分析結(jié)果表明，水仙NtERFs基因在膨大期鱗片中的表達(dá)差異顯著(圖4)。其中，NtERF1、NtERF3、NtERF4、NtERF22和NtERF118的表達(dá)量在5月下旬顯著高于其他時(shí)期，NtERF1、NtERF4和NtERF118的表達(dá)量在種球膨大期間呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)，而NtERF3和NtERF22則表現(xiàn)上升-下降-上升的變化趨勢(shì)，分別在4月上旬和3月下旬出現(xiàn)第一次釋放高峰。NtERF2的表達(dá)量表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)，在4月中旬出現(xiàn)表達(dá)高峰。NtERF26的表達(dá)量在3月份最高，而后下降，在4月下旬又顯著升高。NtERF2和NtERF26的表達(dá)量均在4月23日內(nèi)芽乙烯釋放高峰期顯著升高，這2個(gè)NtERFs可能是鱗片對(duì)內(nèi)芽釋放的乙烯的響應(yīng)因子。從相對(duì)表達(dá)量變化來看，NtERF4和NtERF118的相對(duì)表達(dá)量從3月中旬到5月中旬分別升高2.2倍和2.4倍；NtERF1的相對(duì)表達(dá)量高于其他的NtERFs基因的相對(duì)表達(dá)量，5月中旬的相對(duì)表達(dá)量是3月中旬的5.1倍，且NtERF1表達(dá)與鱗片的乙烯釋放規(guī)律一致，因此推測(cè)，NtERF1、NtERF4和NtERF118參與了鱗片乙烯信號(hào)的響應(yīng)以及水仙種球的生長(zhǎng)，NtERF1可能是關(guān)鍵的因子。

注：A: 水仙鱗片乙烯釋放量；B:水仙內(nèi)芽乙烯釋放量。

2.3 水仙膨大期內(nèi)芽NtERFs的表達(dá)規(guī)律分析

水仙種球內(nèi)芽NtERFs的定量分析結(jié)果表明(圖5)，NtERF1基因在4月3日出現(xiàn)表達(dá)高峰，表達(dá)量是其他時(shí)期的2.5～9.0倍；NtERF2在4月23日的表達(dá)量是其他時(shí)期的7倍左右，其他時(shí)期的表達(dá)量維持在較低水平，且無顯著性差異，NtERF2的表達(dá)高峰與內(nèi)芽的第二次乙烯釋放高峰期相吻合，因此推測(cè)NtERF2基因可能是參與內(nèi)芽乙烯信號(hào)響應(yīng)的重要因子。NtERF3和NtERF4表達(dá)規(guī)律與內(nèi)芽乙烯的釋放規(guī)律基本相符，說明NtERF3和NtERF4也可能參與了內(nèi)芽對(duì)乙烯的響應(yīng)；NtERF22的表達(dá)量在5月初顯著高于其他時(shí)期，NtERF26和NtERF118的表達(dá)量在4月底顯著升高，但這5個(gè)NtERFs的相對(duì)表達(dá)量較低，可能不是內(nèi)芽乙烯釋放和響應(yīng)的主要因子。

注：1～7分別表示3月14日、3月24日、4月3日、4月13日、4月23日、5月3日、5月13日。下同。

圖5 水仙膨大期內(nèi)芽NtERFs基因的表達(dá)量變化

3 討論

研究表明，乙烯抑制植物的生長(zhǎng)，如在根系發(fā)育早期，乙烯抑制了根系伸長(zhǎng)[18-20]。然而，根據(jù)Pierik等[21]提出的雙相乙烯反應(yīng)模型，乙烯對(duì)根系伸長(zhǎng)既有抑制作用又有促進(jìn)作用。Abts等[22]研究表明在甜菜根發(fā)育早期，生長(zhǎng)素促進(jìn)乙烯的合成，從而促進(jìn)了根的生長(zhǎng)發(fā)育，這可能是由于乙烯對(duì)木質(zhì)部的生長(zhǎng)起到促進(jìn)的作用[23]，外源乙烯的處理證實(shí)了乙烯能夠刺激形成層和不定根的生長(zhǎng)[24-25]。對(duì)乙烯敏感型的番茄，乙烯能夠影響其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，在乙烯缺乏的情況下，番茄成年植株顯示出與乙烯相關(guān)的典型變化，如葉片變白、花期提前和果實(shí)脫落加速等[26]。乙烯也能影響鱗莖的生長(zhǎng)發(fā)育。在洋蔥鱗莖分化過程中，乙烯作為鱗莖形成的直接誘導(dǎo)物質(zhì)參與其中[27]。方少忠等[3]研究表明乙烯可誘導(dǎo)百合試管鱗莖的形成和膨大。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)芽乙烯的釋放高峰出現(xiàn)在4月下旬，在同一時(shí)期種球處于迅速生長(zhǎng)階段，說明乙烯可能參與了水仙鱗莖的發(fā)育生長(zhǎng)過程，這與前人的研究結(jié)果一致。

ERF蛋白存在于表現(xiàn)出乙烯三重反應(yīng)的植物中，與乙烯的生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[28]。ERFs是乙烯信號(hào)傳遞途徑的最后一個(gè)下游受體，其傳遞的信號(hào)與ERF基因的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)[29]，且與乙烯調(diào)控的生長(zhǎng)控制有關(guān)，具有正調(diào)控和負(fù)調(diào)控功能[30]。前人研究表明，ERF蛋白通過調(diào)控乙烯生物合成基因的表達(dá)參與乙烯生成的反饋調(diào)節(jié)[31]。抑制ERF蛋白的活性能夠下調(diào)氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶(Aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)和氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO)基因的表達(dá)量，減少乙烯生成量[26]。ERF1是ERF家族成員之一，含有ERF DNA結(jié)合區(qū)域[32]。Yu等[33]研究發(fā)現(xiàn)ERF1正調(diào)控乙烯信號(hào)，與生長(zhǎng)發(fā)育呈正相關(guān)。本研究通過分析NtERF1的表達(dá)規(guī)律，推測(cè)該基因可能在鱗莖發(fā)育的過程中也起到正調(diào)控作用。ERF2蛋白在煙草或番茄中能夠激活乙烯合成途徑基因的表達(dá)[34]，過表達(dá)SlERF2基因能夠引起乙烯的釋放，導(dǎo)致番茄(Solanumlycopersicum)果實(shí)早熟，刺激種子萌發(fā)[35]，MdERF2能夠受到乙烯的調(diào)節(jié)而在蘋果(Malusdomestica)果實(shí)中特異表達(dá)[36]，但MdERF2是通過抑制MdACS1基因的表達(dá)而負(fù)調(diào)控乙烯的生物合成[31]。相反，MdERF3作為MdACS1基因的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)其表達(dá)，MdERF2和MdERF3相互作用，共同調(diào)節(jié)乙烯的生物合成[31]。本研究發(fā)現(xiàn)鱗片中的NtERF2和NtERF3基因的表達(dá)水平也存在著此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，在5月中旬，NtERF2表達(dá)受到抑制，NtERF3的表達(dá)量顯著升高，從而產(chǎn)生大量乙烯，但是在內(nèi)芽中，NtERF2的表達(dá)量則與乙烯的釋放量呈正相關(guān)。因此，本研究認(rèn)為NtERF2和NtERF3基因調(diào)控乙烯生物合成的功能具有組織特異性，2個(gè)基因之間在種球中的相互關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

乙烯通過乙烯信號(hào)途徑刺激維管細(xì)胞的分化[37]，也能通過與其他激素的相互作用，刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)[38]。研究表明，ERF3是根冠生長(zhǎng)的的重要因子，通過調(diào)節(jié)參與細(xì)胞分裂素信號(hào)的基因表達(dá)，促進(jìn)根冠的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[39]，ERF1和ERF4表達(dá)受乙烯和生長(zhǎng)素的影響，與月季花瓣的生長(zhǎng)和脫落有關(guān)[40]，在木本植物中，ERF118和ERF119是木質(zhì)部細(xì)胞的膨脹和次生細(xì)胞壁形成的重要調(diào)控因子，參與了茉莉酸和生長(zhǎng)素介導(dǎo)的生理反應(yīng)[41]，關(guān)于ERF26的功能則鮮見報(bào)道。水仙種球中的水楊酸和玉米素與芽的生長(zhǎng)有關(guān)[42]，本研究發(fā)現(xiàn)，在種球膨大期間，NtERFs基因能夠在鱗片和內(nèi)芽中響應(yīng)乙烯信號(hào)，但是這些基因的表達(dá)是否受到其他激素信號(hào)的影響還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在多花水仙種球膨大期，種球重量逐漸增加，鱗片釋放的乙烯與地上部的衰老有關(guān)，內(nèi)芽釋放大量的乙烯，所釋放的乙烯與種球的膨大有關(guān)，并且能夠誘導(dǎo)鱗片乙烯的釋放。NtERF1、NtERF4和NtERF118基因可能參與鱗片對(duì)乙烯信號(hào)的響應(yīng)，NtERF2、NtERF3、NtERF4和NtERF26基因則可能參與內(nèi)芽乙烯信號(hào)的響應(yīng)，NtERF2可能是鱗片響應(yīng)內(nèi)芽乙烯信號(hào)的紐帶，在種球乙烯的生物合成中具有關(guān)鍵作用。本研究初步分析了乙烯在多花水仙種球膨大期間的作用，為進(jìn)一步了解水仙種球的生長(zhǎng)發(fā)育提供了研究基礎(chǔ)，但由于相關(guān)研究基礎(chǔ)較少，今后應(yīng)進(jìn)一步挖掘乙烯信號(hào)途徑中的相關(guān)受體基因，明確乙烯在多花水仙種球生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用及其信號(hào)傳遞過程。